シークエンサーのあと：NIPTのデマルチプレックスとアライメントの仕組み

NIPTのシークエンサーが出力するのは、何人分もの検体が混ざった数千万〜数億本の短い塩基配列（リード）です。この時点では、どのリードが誰のものか、ゲノムのどこから来たものかはまだ分かりません。このページでは、リードを検体ごとに振り分ける「デマルチプレックス」と、ゲノム上の位置を決める「アライメント」、そのあとに使えないリードを除く工程までを、NIPTの品質管理の視点から解説します。

NIPTの検査は、採血した血液からDNAを取り出してシークエンサーにかければ終わり、というものではありません。シークエンサーが出す大量のデータを、コンピューターで何段階にも処理してはじめて、染色体ごとの量の偏りを判定できるようになります。この処理の前半にあたるのが、デマルチプレックスとアライメントです。シークエンサーの中で何が起きているかはNGSの仕組みで解説しているので、ここではその出力を受け取るところから始めます。

1. シークエンサーから出てくるのは「誰のものか分からない」大量のリード

シークエンサーの出力は、短い塩基配列（リード）と、その1塩基ごとの読み取りの確かさを記録したファイルです。そこには、そのリードがどの検体のものか、ゲノムのどこから来たかという情報は、まだ直接は含まれていません。

1-1. シークエンサーが出力するもの：塩基の並びと品質スコア（FASTQ）

シークエンサーは画像として記録した蛍光の信号を塩基に変換し、リードごとに塩基の並びと1塩基ごとの品質スコアをまとめて、FASTQと呼ばれる形式のファイルに書き出します[1]。品質スコアは読み間違いの確率を対数で表した値で、たとえば「Q30」は1,000回に1回の誤りに相当します[2]。母体血の細胞外DNA（セルフリーDNA）は、もともと約166塩基対を中心とする短い断片で、胎盤由来の断片はそれよりやや短い傾向があります[3]。NIPTのリードは、この短い断片の端から数十塩基程度を読んだものです。

1-2. なぜ振り分けとアライメントが必要か

1回の運転で読める量は、1人分の検査に必要な量よりはるかに多いため、NIPTでは複数の妊婦さんの検体をまとめて読みます。これをマルチプレックスと呼びます。たとえば、12検体をまとめて読んだ検証研究では、1検体あたり400万〜1,000万本のリードが得られていました[4]。まとめて読んだ以上、あとで検体ごとに分け直す必要があります。さらに、NIPTは「21番染色体から来たリードが多いか」を数える検査なので、各リードがどの染色体のどこから来たかを決めなければなりません。前者がデマルチプレックス、後者がアライメントです。

2. デマルチプレックス：インデックス配列で検体ごとに振り分ける

デマルチプレックスとは、検体ごとに付けておいた短い既知の配列（インデックス、バーコードとも呼ぶ）をリードと一緒に読み取り、その配列にしたがってリードを検体ごとのファイルに分ける工程です。多くの場合、シークエンサーに付属するソフトウェアで、FASTQを作るのと同時に行われます。

2-1. インデックス（バーコード）配列とは

インデックスは、ライブラリー調製の段階で、DNA断片の両端に付けるアダプターの中に組み込まれる短い配列です。検体ごとに異なる配列を割り当てておけば、まとめて読んだあとでも、インデックスの部分を読むだけでどの検体のリードかが分かります。郵便物の宛名ラベルのようなものだと考えると分かりやすいでしょう。

2-2. デュアルインデックスと読み違いの許容

インデックスの部分も塩基を読むので、まれに読み間違いが起こります。そこで、インデックスどうしが互いに数塩基以上異なるように設計し、1塩基程度の読み違いなら正しい検体に戻せるようにするのが一般的です。全ゲノム型NIPTの解析法を報告した研究でも、インデックスの不一致を1塩基まで許して振り分けていました[5]。

さらに、アダプターの両端にそれぞれ別のインデックスを付け、2つの組み合わせで検体を特定する方法をデュアルインデックスと呼びます。インデックスを1つだけ使った場合、約0.3%のリードが誤った検体に割り当てられていたのに対し、両端のインデックスを組み合わせると0.001%未満まで下げられたと報告されています[6]。

2-3. インデックスホッピングと検体混入を防ぐ仕組み

インデックスホッピングとは、シーケンスの過程で、ある検体のDNA断片に別の検体のインデックスが付いてしまう現象です。ExAmp方式のパターン化フローセルを用いる一部のIllumina装置では起こりやすく、検体間のインデックス・スワッピングが0.2〜6%の割合で観察されたと報告されています[7]。装置メーカーも、パターン化フローセルでは2%以下の割合で起こりうるとしたうえで、検体ごとに固有の組み合わせを持つデュアルインデックス（ユニーク・デュアルインデックス）を使うよう推奨しています[8]。

ユニーク・デュアルインデックスでは、2つのインデックスの組み合わせが想定どおりでないリードは「どの検体にも属さない」として捨てられます。そのため、ホッピングが起きても、想定外のインデックス組み合わせを持つリードを検出して除外でき、別検体への誤割り当てを大幅に減らせます[8]。NIPTはリード数の小さな偏りを統計的に評価する検査であるため、検体間のリード混入は解析上の誤差要因になり得ます。デマルチプレックスの設計は、検査の正確さを支える目に見えない土台です。

3. アライメント：リードがゲノムのどこから来たかを決める

アライメント（マッピングとも呼ぶ）とは、それぞれのリードを基準となるヒトゲノムの配列と照合し、どの染色体のどの位置から来たかを決める工程です。NIPTはリードを染色体ごとに数える検査なので、この位置決めがすべての前提になります。配列どうしを並べて比べるという一般的な意味についてはアライメントとはで解説しています。

3-1. 参照ゲノムと照合する

照合の基準になるのが、ヒトの参照ゲノム（リファレンスゲノム）です。現在広く使われているGRCh38（hg38）は、それ以前の版の1,000か所以上の問題を修正して公開されたものです[9]。2022年には、隙間のない完全なヒトゲノム配列として約30.55億塩基対の配列が報告されています[10]。アライメントでは、数十塩基のリードが、この約30億塩基のヒトゲノムのどこに当てはまるかを探します。

3-2. 30億塩基の中から数分で探せる理由

1本のリードを30億か所すべてと突き合わせていては、数千万本のリードを処理するのに膨大な時間がかかります。そこで、参照ゲノムをあらかじめ検索しやすい形に並べ替えた「索引（インデックス）」を作っておく方法が使われます。Burrows-Wheeler変換という手法で作った索引を使うアライナーとして、BWAやBowtieが知られています。BWAは従来の方法より10〜20倍速く[11]、Bowtieは1台のCPUで1時間に2,500万本以上のリードを処理できると報告されました[12]。参照ゲノムは変わらないので、一度索引を作れば何度でも使えます。このような索引化により、大量の短いリードを現実的な計算時間で参照ゲノムへ配置できます。

3-3. 完全一致だけを使うか、わずかな違いを許すか

妊婦さん一人ひとりのゲノムは参照ゲノムと完全には同じではなく、SNP（一塩基多型）などの違いがあります。読み取りの誤りもあるため、一般的なアライナーは数塩基の違いを許して位置を探します[11]。一方、NIPTの初期の研究では、反復配列を除いた参照ゲノムに1か所だけ完全一致したリードだけを使っていました[13]。全ゲノム型NIPTの解析法でも、不一致を許さずに位置を決めています[5]。NIPTは個々の塩基の違いを見る検査ではなく、リードの数を正確に数える検査なので、位置の確かさを優先して条件を厳しくする考え方がとられているのです。

4. アライメントのあとで除くリード

アライメントが終わっても、すべてのリードを数えるわけではありません。位置が1か所に決まらないリードや、同じ断片が増幅されて重複したリードを除き、数える価値のあるリードだけを残します。

4-1. 位置が1か所に決まらないリード

ヒトゲノムのおよそ半分は、Alu配列やLINEなどの転移因子に由来する反復配列です[14]。反復配列やそれに由来する配列はゲノムの66〜69%を占めるという推定もあります[15]。同じような配列が何か所にもある領域から来た短いリードは、どこが本当の由来か決められません。75塩基のリードでも、ヒトゲノムのほぼ20%は位置を一意に決められない領域として残ると計算されています[16]。

こうしたリードを数えに入れると、特定の区間だけが不自然に多くなったり少なくなったりして、判定をゆがめます。そのためNIPTでは、1か所に一意に決まったリードだけを使うのが基本です。初期の研究では、条件を満たして使われたリードは全体の約20%にすぎませんでした[13]。読んだリードの多くを捨ててでも、位置の確かなリードだけで数えることが、NIPTの精度を支えています。

4-2. PCRで増えた重複リード

ライブラリー調製ではPCRでDNAを増やすため、同じ1本の断片から複数のリードが生じることがあります。これを重複リードと呼びます。重複リードをそのまま数えると、たまたま多く増えた断片の分だけ、その区間のリード数が水増しされてしまいます。全ゲノム型NIPTの解析法では、強く重なり合うリードのうち最初の1本だけを残し、ほかを除く処理を行っていました[5]。

4-3. 品質管理の基準とリード数が足りないとき

こうして残った一意で重複のないリードの数が、判定に使える「材料」の量です。この数が少ないと、染色体ごとのわずかな差を統計的に区別できなくなります。21トリソミーの研究では、2検体をまとめて読んだ場合の感度は100%だったのに対し、8検体をまとめて1検体あたりのリードが減った場合は79.1%に下がりました[17]。有効リード数が各検査系で定めた品質基準を満たさない場合には、判定不能・判定保留として再採血や再検査が検討されることがあります。リード数の意味はシーケンス深度（リード深度）を、結果が出ない場合の対応はNIPT結果が出ない原因と対処法を参照してください。判定保留にはもう1つ、胎盤由来のDNAの割合が低いという原因もあり、こちらは胎児ゲノム率（胎児分画）で解説しています。

5. SNP法では何が違うか

ここまでの説明は、ゲノム全体からランダムにリードを読む全ゲノム型（WGS法）を前提にしています。SNP法では、あらかじめ決めた領域だけを増やして読むため、アライメントのあとに数えるものが異なります。SNP法の代表的な検査の初期の研究では、約11,000か所のSNPを狙って増幅し、それぞれの位置で母親と胎児由来のアレルの比を調べていました[18]。デマルチプレックスとアライメントが必要なのは同じですが、その後は「区間ごとのリード数」ではなく「SNPごとのアレルの数」を数える点が違います。詳しくはSNPベースのNIPTで解説しています。シークエンサーを使わない方式についてはNGS以外のNIPT技術で扱います。

6. このあと：区間ごとに数えて判定へ

デマルチプレックス、アライメント、フィルタリングを終えたリードは、ゲノムを一定の幅で区切った区間（ビン）ごとに数えられ、補正を経て判定に使われます。全ゲノム型NIPTの解析法の例では、1Mbごとの区間でリードを数えていました[5]。また、初期の研究から、GC含量の高い・低い領域ではリードの数が偏りやすいことが知られており[13]、この偏りを補正する工程も欠かせません。

区間ごとの数え方はリードの密度とは、区間の幅の決め方はビンの最適サイズとは、判定に使う指標はZスコアとはで解説しています。全体の流れはWGSで測るNIPTにまとめています。

7. まとめ：結果の数字はコンピューター処理の積み重ね

NIPTでは、シークエンサーが読んだ大量のリードを、インデックスで検体ごとに振り分け、参照ゲノムと照合して位置を決め、位置の確かなリードだけを残してから数えます。デュアルインデックスは別の検体のリードが混ざるのを防ぎ、一意なリードだけを使うことは反復配列による数のゆがみを防ぎます。使えるリードが足りなければ、無理に結果を出さずに再検査とします。報告書に書かれた1つの判定の裏には、こうした何段階もの選別と品質管理があります。次の工程である区間ごとの数え方と判定については、第3章で詳しく解説しています。

よくある質問（FAQ）

参考文献

• [1] The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants. Nucleic Acids Res. 2010;38(6):1767-1771. [PubMed 20015970]
• [2] Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 1998;8(3):186-194. [PubMed 9521922]
• [3] Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci Transl Med. 2010;2(61):61ra91. [PubMed 21148127]
• [4] Limited Clinical Utility of Non-invasive Prenatal Testing for Subchromosomal Abnormalities. Am J Hum Genet. 2016;98(1):34-44. [DOI 10.1016/j.ajhg.2015.11.016]
• [5] WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme. Nucleic Acids Res. 2014;42(5):e31. [DOI 10.1093/nar/gkt992]
• [6] Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 2012;40(1):e3. [PubMed 22021376]
• [7] Characterization and remediation of sample index swaps by non-redundant dual indexing on massively parallel sequencing platforms. BMC Genomics. 2018;19(1):332. [DOI 10.1186/s12864-018-4703-0]
• [8] Illumina, Inc. Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis (White paper, 770-2017-004). [Illumina]
• [9] Evaluation of GRCh38 and de novo haploid genome assemblies demonstrates the enduring quality of the reference assembly. Genome Res. 2017;27(5):849-864. [PubMed 28396521]
• [10] The complete sequence of a human genome. Science. 2022;376(6588):44-53. [DOI 10.1126/science.abj6987]
• [11] Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-1760. [PubMed 19451168]
• [12] Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009;10(3):R25. [DOI 10.1186/gb-2009-10-3-r25]
• [13] Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(51):20458-20463. [DOI 10.1073/pnas.0810641105]
• [14] Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409(6822):860-921. [DOI 10.1038/35057062]
• [15] Repetitive elements may comprise over two-thirds of the human genome. PLoS Genet. 2011;7(12):e1002384. [DOI 10.1371/journal.pgen.1002384]
• [16] Fast computation and applications of genome mappability. PLoS One. 2012;7(1):e30377. [DOI 10.1371/journal.pone.0030377]
• [17] Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011;342:c7401. [DOI 10.1136/bmj.c7401]
• [18] Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn. 2012;32(13):1233-1241. [DOI 10.1002/pd.3993]

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