WGSベースのNIPT：リードの密度で胎児の染色体の量を比べる仕組み

WGSベースのNIPTは、母体の血液に含まれるDNAの断片を数百万〜数千万本読み、どの染色体から来た断片がどれだけあるかを数えて、胎児の染色体の数の変化を見つける検査です。このとき比べるのは、断片の「本数」ではなく、染色体の長さあたりの本数である「リードの密度」です。21番染色体はゲノム全体の約1.5%しかなく、胎児由来のDNAが2%しかない検体では、胎児の21番染色体から来た断片は全体の約3,300本に1本にすぎません。このページはNIPTの教科書シリーズ第3章の3-2-1として、その小さな変化をどうやって統計的に捉えるのかを、計算例とともに臨床遺伝専門医の立場から解説します。

NIPTの教科書シリーズの共通画像です。本記事では、WGSベースのNIPTで染色体由来のDNA量をリード密度から評価する原理を説明します。

1. 結論：WGSベースのNIPTは「染色体ごとのDNAの量」を比べる検査

WGSベースのNIPTは、母体血漿中の細胞外DNA（cfDNA）をランダムに数百万〜数千万本読み、それぞれの断片がどの染色体から来たかを決めて、染色体ごとの量を比べる検査です。WGSは全ゲノムシーケンス（whole genome sequencing）の略で、特定の場所だけを狙わずにゲノム全体から満遍なく断片を読むことを意味します。病気の原因となる遺伝子の変化を1塩基ずつ調べるための全ゲノム解析とは違い、NIPTでは1つひとつの断片の塩基配列そのものよりも、「どこから来た断片が何本あったか」という数を使います。

母体の血液中を流れているcfDNAの大部分は母体自身の細胞に由来し、一部が胎盤の細胞に由来します。後者を胎児由来の部分とよび、全体に占める割合を胎児分画（胎児ゲノム率）といいます。胎児と胎盤の染色体構成が一致する21トリソミーでは、胎盤由来の部分に21番染色体が3本分含まれるため、血漿全体で見ると21番染色体由来の断片がほんのわずかに増えます。WGSベースのNIPTは、この「ほんのわずかな増加」を検出する仕組みです。胎児と胎盤の染色体構成が異なる場合もあるため、胎児の診断を確定する検査ではありません。cfDNAそのものについてはセルフリーDNA（cfDNA）とはで、胎児分画の考え方は胎児ゲノム率（胎児分画）で説明しています。

採血から判定までの流れ

WGSベースのNIPTは、採血した血液から血漿を分け、そこに含まれるcfDNAを抽出するところから始まります。抽出したDNAの断片の両端に、シーケンサーで読むための共通配列と検体ごとの目印を付け（ライブラリー調製）、多数の検体をまとめてシーケンサーで読みます。読んだ断片を検体ごとに仕分けてから参照ゲノムに当てはめ、染色体ごと、さらに小さな区画ごとにリードを数え、補正したうえで統計的に判定します。このページで扱うのは、このうち「数えて比べる」部分の考え方の土台です。抽出とライブラリー調製は第2章のDNAの抽出とライブラリー調製で説明しています。

2008年に示された原理

母体血漿のDNAを大量並列シーケンスで読み、染色体ごとの断片の割合から胎児の21トリソミーを見分けられることは、2008年に2つの研究グループが相次いで報告しました[1][2]。どちらも、21番染色体由来の断片の割合を正常な妊娠の検体と比べ、21トリソミーの妊娠ではその割合が統計的に高くなることを示しました。その後、検体の中だけで比較を完結させる方法や、より小さな欠失・重複まで検出する方法が開発され、2019年には解析時間を大幅に短縮した改良版も報告されています[3][4]。基本の考え方は今も変わっておらず、それが「リードの密度を比べる」という発想です。

NIPTの3つの方式の中でのWGS

NIPTの解析法は、大きく分けて3つあります。ゲノム全体から無作為に断片を読むWGSベース、特定の一塩基多型（SNP）を狙って増やし母体と胎児の違いを読み分けるSNPベース、そして特定の領域の断片をマイクロアレイ上で数えるマイクロアレイベースです。WGSベースの強みは、ゲノム全体を同じ方法で数えるため、13・18・21番に限らず、すべての染色体や比較的大きな欠失・重複へと解析を広げやすいことです。全染色体を対象とするNIPTの多くがこの方式をとるのはそのためです。一方で、断片の「数」だけを頼りにするため、数え方の偏りやゆらぎをどれだけ抑えられるかが性能を左右します。第3章のWGSのページが補正や統計の話に多くを割くのは、この性質のためです。

2. 目標は「胎児分画が低くても見つけること」

WGSベースのNIPTの解析アルゴリズムを理解する出発点は、その目標を「胎児分画が低い検体でも、胎児の染色体全体や比較的大きな領域のコピー数の変化を高い感度で検出すること」と置くことです。ここでいうコピー数の変化とは、染色体が1本多いトリソミーや1本少ないモノソミー、さらに染色体の一部が欠けたり増えたりする微細欠失・重複を含みます。

なぜ「低い胎児分画」が基準になるのか

胎児分画は妊娠ごとに大きく違い、高い検体では20%を超えることもあれば、低い検体では数%にとどまることもあります。トリソミーによる増加量は胎児分画に比例するので、胎児分画が高い検体では変化が大きく、見つけるのは比較的やさしくなります。同じ異常と同じ品質条件を比べるなら、低い胎児分画でも検出できる設計では、高い胎児分画ほど統計的に検出しやすくなります。つまり、「低い胎児分画で感度が保てるか」が、アルゴリズムが乗り越えるべき課題を具体的に示し、性能を評価する物差しにもなるのです。検査の感度そのものの考え方はNIPTの精度（感度・特異度・陽性的中率）で解説しています。

血漿中のDNAの大部分は母体のもの

もう1つ前提として押さえておきたいのは、血漿中のcfDNAの大部分は母体の血液細胞などに由来し、胎児（胎盤）由来の部分はそのごく一部にすぎないという点です。胎児分画が10%なら残りの90%、2%なら98%が母体のDNAです。母体の常染色体にコピー数の変化がない場合、母体由来のDNAでは、胎児の染色体の状態に関係なく各常染色体が2本分ずつ存在します。つまり、NIPTが見つけようとしている胎児の変化は、常に大量の母体のDNAに薄められた形でしか観察できません。WGSベースのNIPTの解析は、この「薄められた変化」をどう取り出すかという問題だと言い換えることもできます。

計算：胎児の21番由来の断片は約3,300本に1本

具体的な数字で考えてみます。ヒトの参照ゲノム（GRCh38）の全長は約31億塩基対で、21番染色体はそのうち約4,670万塩基対、つまり約1.5%を占めます[5]。胎児分画が2%の検体で、cfDNAが染色体の長さに比例して満遍なく存在すると仮定すると、胎児の21番染色体から来た断片の割合は次のようになります。

21トリソミーでは、この胎児の21番染色体の量が2本分から3本分へ、つまり50%増えます。しかし血漿全体で見ると、21番染色体由来の断片は母体の分も合わせて全体の1.5%あり、そのうち胎児の分は50分の1にすぎません。胎児の分が50%増えても、21番由来の断片全体では、全リード数の正規化による小さな影響を無視すると、約「1＋胎児分画÷2」倍、胎児分画2%なら1.01倍、つまりわずか1%しか増えないのです。この1%の増加を、偶然のばらつきと区別しなければなりません。

胎児分画と増加量の関係

トリソミーによる増加量が胎児分画にどう比例するかを、表にまとめておきます。モノソミーや片方の染色体の欠失では、同じ大きさだけ減ります。

この関係は、逆向きに使うこともできます。トリソミーがあると分かっている検体では、その染色体の増加量から胎児分画を推定できるのです。また、観察された増加量が、別の方法で推定した胎児分画から予想される量よりはっきり小さい場合は、胎盤の一部だけに変化があるモザイクや、母体側の要因を疑う手がかりになります。胎児分画を推定する方法は胎児ゲノム率のページで扱います。

3. 何百万本ものリードが必要になる理由

1%の増加を偶然のばらつきと区別するには、21番由来の断片を十分な本数だけ数える必要があります。理想条件で、期待される増加分がゆらぎの3倍になる総リード数は、胎児分画2%で約600万本、4%で約150万本です。とくに胎児分画が低い検体では、数千本や数十万本を無作為に読んだだけで、21トリソミーの検体と正常な検体を十分な精度で見分けることは困難です。

数えるときの「ゆらぎ」を見積もる

全部でN本のリードを読み、そのうち21番由来の割合がp（約1.5%）だとすると、21番由来のリードは平均でN×p本になります。ただし、断片は無作為に読まれるので、同じ検体をもう一度読んでもまったく同じ本数にはなりません。総リード数Nを固定した場合、この「数えるときのゆらぎ」は理想条件で二項分布に従います。pが小さいためポアソン分布で近似でき、ばらつきの大きさ（標準偏差）は平均の平方根、つまり√(N×p)になります[8]。

一方、21トリソミーによる増加分は、平均のN×p本に胎児分画f÷2を掛けた量です。増加分がゆらぎの何倍あるかを考えると、次の式になります。

この式に、21番の割合p=0.015と、いくつかの胎児分画fを入れてみます。

胎児分画が半分になると、必要なリード数は4倍になります。胎児分画が式の中で2乗で効いてくるためです。たとえば1,000万本読んだ検体では、胎児分画4%なら増加分はゆらぎの約7.8倍となり、理想条件では検出しやすくなりますが、2%では約3.9倍まで下がります。胎児分画が低い検体ほど判定が難しくなり、一定の値を下回ると判定保留とされる理由が、この計算からも見えてきます。胎児分画の基準と再検査の考え方は胎児ゲノム率が低いときのページで詳しく扱っています。

13番・18番では必要なリード数が変わる

同じ式を13番と18番に当てはめると、染色体が長いほど1回の検査で数えられる本数が多くなるため、必要なリード数は少なくなります。胎児分画4%で計算すると、21番（ゲノムの1.51%）では約150万本が必要なのに対し、18番（2.59%）では約87万本、13番（3.69%）では約61万本で、期待される信号がゆらぎの3倍になります。数えるときのゆらぎだけを考えれば、13トリソミーや18トリソミーのほうが21トリソミーより見つけやすいことになります。

ところが実際には、13番と18番は21番より判定が難しい染色体として知られています。その大きな理由の1つが、次の項で触れるGC含量の偏りです。13番や18番はゲノムの平均よりGC含量が低い領域が多く、検体ごとに読まれやすさが変わりやすいため、理想的な計算よりばらつきが大きくなります。数えるときのゆらぎは本数を増やせば小さくできますが、検体ごとの偏りは本数を増やしても消えません。理想の計算と現実の性能の差を埋めるのが、次のページ以降で扱う補正の役割です。

実際のばらつきは理想より大きい

ここまでの計算は、断片がゲノム全体に完全に均一に分布し、ばらつきは数えるときのゆらぎだけ、という理想的な仮定にもとづいています。実際の検体では、DNAの抽出やライブラリー調製、シーケンスの過程で、GC含量の高い断片や低い断片が読まれにくくなるなどの偏りが生じます。偏りの程度は検体ごとにも違うため、染色体ごとのリード数のばらつきは、理想的なポアソン分布のばらつきより大きくなります。解析アルゴリズムの目標は、こうした余分なばらつきを補正で取り除き、理論上の最小値である数えるときのゆらぎに近づけることです。その具体的な方法は平均ビン値とGC補正で説明します。

「浅く広く」読むという設計

ここで必要なのは、1つの場所を何十回も重ねて読む深さではなく、ゲノム全体から十分な本数の断片を数えることです。数百万〜数千万本の短いリードで得られる平均カバレッジは、リード長やペアエンドかどうかにも依存しますが、多くのNIPTでは1倍前後以下の低い量で、こうした読み方は浅いシーケンス（低カバレッジ全ゲノムシーケンス）とよばれます。2014年に報告された解析法では、ゲノム全体を平均0.15〜1.66倍程度しか覆わない浅いシーケンスでも、研究で評価した13・18・21番のトリソミー症例をすべて検出できたと報告されています[3]。同じ場所を重ねて読む深さの考え方はシーケンス深度（リード深度）で説明しています。

浅く広く読む設計には、もう1つ利点があります。1回のシーケンスで読める総リード数は機器ごとにほぼ決まっているので、1検体あたりの必要リード数が少なければ、多くの検体を同時に読むことができ、検査の費用を下げられます。検体ごとに目印（インデックス）を付けて混ぜて読み、あとで仕分ける方法については、第2章のデマルチプレックスとアライメントで説明しています。

4. 読んだ断片を参照ゲノムに当てはめる（マッピング）

WGSベースのNIPTの解析の最初の工程は、シーケンサーが読んだ数百万本の断片（リード）を、ヒトの参照ゲノムのどこに当たるかを決めること（マッピング、アライメント）です。これによって、それぞれのリードがどの染色体のどの位置から来たのかが分かり、染色体ごとのリード数を数えられるようになります。

約31億塩基対の参照ゲノムに数百万〜数千万本の短いリードを当てはめる作業は、一見とても重い計算に思えます。しかし、2009年に報告されたBowtieやBWAといったプログラムは、参照ゲノムを圧縮した索引（Burrows–Wheeler変換にもとづく索引）を使うことで、短いリードを高速かつ少ないメモリで当てはめられるようにしました[6][7]。こうした技術のおかげで、現在の解析パイプラインは数百万本のリードを短時間でマッピングできます。

短いリードで十分な理由

NIPTのシーケンスでは、1本の断片を端から端まで全部読む必要はありません。目的は断片の出どころを決めて数えることなので、断片の片側の端から数十塩基を読めば、多くの場合ゲノム上の位置を1か所に決められます。31億塩基対のゲノムでも、数十塩基の並びがまったく同じ配列が偶然ほかの場所に現れることは、反復配列を除けば多くありません。短く読むほど読み取りサイクル数やデータ量を抑えられるので、数を稼ぎたいNIPTには都合がよいのです。2009年のBWAの論文でも、当時のシーケンサーが1回の運転で5,000万〜2億本の短いリードを生み出すことが、高速なマッピング法を開発する動機として挙げられています[7]。

一方、断片の長さそのものにも情報があります。胎盤由来のcfDNAは母体由来のものよりやや短い傾向があることが知られており、断片の長さの分布を胎児分画の推定などに利用する方法もあります。断片の両端を読むペアエンドのシーケンスを使えば、断片の長さも同時に分かります。このページで扱う「数えて比べる」解析では、まず数を正確に数えることが中心になります。

どこにも一意に当てはまらないリード

マッピングで注意が必要なのは、ゲノムの中に同じ配列が何度も繰り返し現れる場所です。たとえばゲノム中に何千回、何万回と出現する反復配列に由来するリードは、どの場所から来たのかを一意に決められません。このようなリードを無理にどこかへ割り当てると、特定の場所に見かけ上のリードが積み上がり、ほかの場所が減ってしまいます。そのため、NIPTの解析では一意に当てはまったリードだけを数え、一意に当てはまらない領域はあらかじめ除外（マスク）して扱います。この補正の詳しい方法は平均ビン値とGC補正のページで説明します。

この点は、21番のような小さな染色体の評価にも関わります。21番、13番、14番、15番、22番は端に近い位置に動原体をもつアクロセントリック染色体で、短腕の大部分は反復配列からなり、GRCh38では配列が確定していない部分を含みます。そのため、実際に一意にマッピングされるリードの割合は、染色体の全長から計算した1.5%より少し低くなります。染色体の「長さ」として何を使うかは、後で見る「密度」の計算に影響するため、解析ではマッピング可能な塩基の数を基準にします。

5. リードの「数」ではなく「密度」で比べる

21番染色体のリード数が「期待より多いか」を判断するとき、染色体ごとのリード数をそのまま比べることはできません。リード数は染色体の長さに比例するからです。染色体の長さで割った「リードの密度」にすれば、長さの影響が消え、染色体どうしを同じ物差しで比べられます。

すぐに思いつく方法は、21番が2本ある正常な検体と比べることです。たとえば、1番染色体は2本あるものとみなし、1番にマッピングされたリード数から、21番に来るべきリード数を予想してみる、という考え方です。ところが、正常な検体でも、1番染色体のリードが約80万本あるのに対して、21番染色体は約15万本しかありません。これは21番の数が少ないからではなく、21番が1番の5分の1以下の長さしかないからです。

表のとおり、リード数は1番の約80万本から21番の約15万本まで大きく違いますが、長さあたりのリード数（リードの密度）は、どの常染色体でも同じ約3,226本になります。均一な読み取りを仮定した理想条件では、正常な検体の常染色体の密度がほぼそろいます。実際には、GC含量やマッピング可能性などの補正も必要です。これが、WGSベースのNIPTで染色体の長さに関係なく比較するための指標として、リードの密度を使う理由です。

密度でそろえることには、もう1つの意味があります。GC含量やマッピング可能性を補正した正常な検体では、常染色体の密度がほぼ同じになると期待されるので、特定の染色体だけでなく、すべての染色体の密度を並べて眺めることで、検体全体の状態を確かめられるのです。たとえば複数の染色体の密度が同時に大きくずれていれば、検体の品質の問題や、母体側の要因、ごくまれには母体の腫瘍に由来するDNAの影響などを考える手がかりになります。1つの染色体だけを見る方法より、ゲノム全体を同じ物差しで見られることが、WGSベースのNIPTの大きな利点です。

21トリソミーでは密度がどれだけ変わるか

同じ1,000万本の検体で、胎児分画が4%、胎児が21トリソミーだったとします。21番由来のリードは、全リード数の正規化による小さな影響を無視すると、約「1＋0.04÷2」倍、つまり1.02倍になり、約15万1,000本が約15万4,000本に増えます。密度で言えば、約3,226本が約3,291本になる計算です。ほかの染色体がすべて約3,226本にそろっている中で、21番だけが約2%高い。WGSベースのNIPTが探しているのは、このような差です。

ただし、ここで示したのはあくまで理想的な計算です。実際の検体では、DNAの断片がゲノム全体に完全に均一に分布するわけではありません。GC含量の高い領域や低い領域ではリードが少なくなりやすく、母体自身のコピー数の変化があればその部分の密度は大きく変わります。また、21番は小さな染色体なので、もともとの本数が少ない分、偶然のゆらぎの影響も受けやすくなります。2%の差を確実に見分けるには、こうした偏りを取り除き、密度を正確に測る工夫が欠かせません。それが、次のページ以降で扱うビンの設計と補正の話につながります。

微細欠失ではどうなるか

同じ考え方を、染色体の一部が欠ける微細欠失に当てはめてみます。たとえば300万塩基対（3Mb）の欠失は、ゲノム全体の約0.1%にすぎません。胎児がこの欠失を片方の染色体にもつと、その領域の胎児由来のDNAは2本分から1本分に減り、血漿全体では、全リード数の正規化による小さな影響を無視すると、約「1−胎児分画÷2」倍になります。トリソミーと同じ式で必要なリード数を計算すると、期待される減少分が標準偏差の3倍になる理想条件の目安は、胎児分画10%で約370万本、胎児分画4%で約2,300万本です。これだけで実際の検査の感度を保証することはできません。

つまり、小さな領域ほど、そして胎児分画が低いほど、検出に必要なリードは急激に増えます。微細欠失の検出が13・18・21番のトリソミーより難しく、検出できる大きさや胎児分画に下限が設けられているのはこのためです。微細欠失をどのように見つけるのか、その仕組みは微細欠失の同定で詳しく解説します。

「割合」と「密度」は同じものか

2008年の研究では、21番にマッピングされたリードが全体に占める割合（％chr21）を正常な検体と比べる方法がとられました[2]。割合は総リード数で割った値であり、染色体の長さの違いは残るため、同じ染色体を正常検体と比較して評価します。一方、密度は染色体や領域の長さで割った値であり、総リード数なども正規化することで領域どうしを比較できます。密度のほうが「長さあたり」という形で表されるため、ゲノムを小さな区画に分けて区画ごとに比べるときにも、そのまま使える点です。染色体全体ではなく、染色体の一部の欠失や重複を見つけるには、区画ごとの比較が必要になります。そこで導入されるのが「ビン」です。

6. 密度を測るための「ビン」と、第3章の流れ

リードの密度は、各染色体を重ならない同じ大きさの区画（ビン）に区切り、ビンごとのリード数を数え、調べたい領域のビンの値を平均することで求めます。このとき決めなければならないのは、ビンの大きさと、ビンの値を平均する方法の2つです。

たとえばビンを5万塩基対にすると、ヒトゲノム全体は約6万2,000個のビンに分かれ、21番染色体は約930個のビンになります。総リード1,000万本の検体なら、1つのビンには平均で約160本のリードが入る計算です。ビンを小さくすれば細かい場所の変化を捉えられますが、1つのビンに入るリードが減って、ゆらぎが大きくなります。逆にビンを大きくすれば1つのビンのゆらぎは小さくなりますが、局所的な変化が同じビン内の正常領域と平均化され、小さな欠失・重複を捉えにくくなります。この兼ね合いはビンの最適サイズで詳しく説明します。

ビンの値をまとめる方法にも工夫が必要です。単純な平均は、一部のビンに極端な値があるとそれに引きずられます。たとえば母体自身が小さな重複をもっていると、その部分のビンだけリードが大きく増え、平均をつり上げて偽陽性の原因になりえます。そのため、解析方法に応じて、外れ値の除外や、中央値など外れ値の影響を受けにくい頑健な統計を用います。母体のコピー数の変化を解析の側からどう扱うかは母親のコピーナンバーバリアントで、偽陽性の原因としての臨床的な意味は第5章の母体側の要因で説明しています。

第3章のWGSベースのNIPTで扱うこと

リードの密度という指標が決まると、その先は「密度をどれだけ正確に測るか」と「測った密度をどう判定するか」の問題になります。第3章のWGSベースのNIPTのページは、次の順に進みます。

• ビンの最適サイズ：ビンを大きくしたい理由と小さくしたい理由
• 平均ビン値とGC補正：密度を正確に測るための補正と頑健な統計
• 母親のコピーナンバーバリアント：母体由来の大きな変化を見分けて除く方法
• リード密度の期待値：正常ならどのくらいの密度になるはずかの決め方
• Zスコア：観察値と期待値の差を判定に使う数値にする
• 性染色体異数性：XとYを組み合わせて判定する方法

なお、NIPTにはWGSのほかに、一塩基多型（SNP）の違いを使って母体と胎児を見分ける方法や、マイクロアレイを使う方法もあります。それぞれSNPベースのNIPTとマイクロアレイベースのNIPTで説明しています。染色体の一部の欠失を見つける仕組みは微細欠失の同定で扱います。

よくある質問（FAQ）

7. まとめ

WGSベースのNIPTは、母体血漿中のcfDNAを全ゲノムから浅く広く読み、染色体ごとのDNAの量を比べる検査です。解析の目標は、胎児分画が低い検体でもトリソミーや大きな欠失・重複を見つけることにあり、胎児分画2%では胎児の21番由来の断片は約3,300本に1本、21トリソミーで増えるのは21番由来の断片全体のわずか1%です。この差を偶然のゆらぎと区別するために、数百万本以上のリードが必要になります。

読んだ断片は参照ゲノムにマッピングされ、染色体ごとに数えられます。ただしリード数は染色体の長さに比例するため、長さあたりの「リードの密度」にして比べるのが基本です。密度はゲノムをビンに区切って測り、その大きさや補正、期待値、Zスコアへと解析が進んでいきます。次のページでは、ビンの大きさをどう決めるかを解説します。

参考文献

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• [2] Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(51):20458-20463. [PubMed 19073917]
• [3] Straver R, Sistermans EA, Holstege H, Visser A, Oudejans CBM, Reinders MJT. WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme. Nucleic Acids Res. 2014;42(5):e31. [DOI 10.1093/nar/gkt992]
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