NGSの仕組み：クラスター形成から塩基配列の読み取りまで

次世代シーケンサー（NGS）は、DNA断片をガラスの板の上に固定してその場で増やし、色のついた塩基を1つずつ取り込ませながら写真を撮ることで、数億本の断片の塩基配列を同時に読み取る装置です。NIPTはこの装置がなければ成り立たない検査ですが、装置の中で何が起きているのかは、検査を受ける方にはほとんど見えません。このページはNIPTの教科書シリーズ第2章の5ページ目として、代表的なイルミナ方式を例に、クラスター形成から塩基配列の読み取りまでの流れを順に説明します。あわせて、NIPTでは配列を読むことより「数を数えること」が目的であるため、シーケンサーの使い方が一般的な遺伝子検査と大きく違う点も、臨床遺伝専門医の立場から整理します。

1. 次世代シーケンサーは何をしている機械か

イルミナ方式の次世代シーケンサーの原理は、「DNA断片をフローセルに固定し、ブリッジ増幅でクラスターを作り、蛍光で標識した塩基を1つずつ取り込ませて撮影する」ことの繰り返しです。この方式は2008年に、ヒトのゲノム全体を高い精度で読み取れることが示されました[1]。次世代シークエンサー（NGS）の定義や臨床で使われる場面の全体像は用語のページにまとめているので、このページでは装置の中で起きていることに絞って説明します。

装置の役割をひとことで言うと、ライブラリーと呼ばれる下ごしらえ済みのDNA断片の集まりを、「1断片が1行」の巨大なテキストファイルに変えることです。入ってくるのは試験管の中の目に見えない分子、出てくるのはA・C・G・Tの文字列と、それぞれの文字がどのくらい確かかを示す数字です。塩基配列を読むという行為そのものの基本は、DNAシークエンシングで解説しています。

サンガー法との違い

サンガー法と次世代シーケンサーの違いは、「1本を長く読む」か「短い断片を数億本同時に読む」かです。1970年代に開発されたサンガー法は、1回の反応で1種類の鋳型から数百塩基を読み取ります。精度は高いものの、ヒトゲノム計画ではこの方法で約30億塩基対を読むのに長い年月と莫大な費用がかかりました。

次世代シーケンサーは、サンガー法の基本的な考え方を受け継いでいます。DNAを合成する酵素であるポリメラーゼに1塩基ずつ相補的な塩基を付け足させ、その塩基を蛍光の色で見分ける、という点は同じです。違うのは規模です。数億か所でサンガー法に似た反応を同時に進めるイメージで、大量並列シーケンス（massively parallel sequencing）とも呼ばれます。1本あたりに読める長さは短くなりましたが、1回の運転で得られる配列の総量が桁違いに増え、1塩基あたりの費用と時間が大きく下がりました[2]。

NIPTに次世代シーケンサーが欠かせない理由

NIPTが調べるのは、妊婦さんの血漿中を流れるセルフリーDNA（cfDNA）です。cfDNAは長さ150〜170塩基ほどの短い断片で、そのうち胎盤に由来するものは1割前後にすぎません。胎盤に由来する断片は、母体に由来する断片よりも系統的に短いことも分かっています[3]。

21トリソミーの胎盤では21番染色体のDNAがわずかに多く出てきますが、その差は全体から見ればごく小さなものです。この小さな差を統計的に見分けるには、数百万本単位の断片について「どの染色体から来たか」を調べる必要があります。2008年に、母体血漿のDNAを大量並列シーケンスで読み、21番染色体由来の断片の割合から胎児のトリソミーを見分けられることが2つのグループから報告され[4][5]、これが今日のNIPTの出発点になりました。1本ずつ読むサンガー法では、この量はとても扱えません。

2. フローセル：DNA断片を並べる土台

フローセルは、内側の表面に短いDNA（オリゴヌクレオチド）がびっしり固定されたガラスの板で、試薬を流す細い流路を備えています。読み取りの化学反応はすべてこの板の上で起こり、カメラもこの板を撮影します[1]。

アダプターでフローセルに結合する

シーケンサーにかける前のライブラリー調製で、cfDNAの各断片の両端には、メーカーが決めた共通の配列（アダプター）がつけられます。フローセルの表面に固定されているオリゴは、このアダプターと相補的に結合する配列です。1本鎖にしたライブラリーを流し込むと、断片はアダプターを介してフローセル表面のランダムな位置に結合し、その後はその場所にとどまります。アダプターの付け方や、検体ごとの目印になるインデックス配列については、前のページのシークエンサーにかける前：DNAの抽出とライブラリー調製で説明しています。

ここで大切なのが、流し込む濃度です。濃すぎると複数の断片が同じ場所に重なり、後で光を見分けられなくなります。薄すぎるとフローセルの場所が余り、1検体あたりに読める断片の数が足りなくなります。NIPTでは1検体あたりの断片の数が判定の確かさに直結するため、この濃度の調整は検査の精度にかかわる工程です。

フローセルに流し込む前には、ライブラリーの濃度と断片の長さの分布を測り、検体ごとの量をそろえてから混ぜ合わせます。検体ごとの量がそろっていないと、同じフローセルの中で多く読まれる検体とあまり読まれない検体が生じます。後者は、必要なリード数に届かずに再解析や再採血が必要になる原因になります。シーケンサーの性能が高くても、その前の段階で量をそろえる地道な作業が、結果の安定性を支えています。

パターン化フローセル

初期のフローセルでは、断片はガラスの上のどこにでも結合しました。新しい装置では、規則正しく並んだ微小なくぼみ（ナノウェル）を持つパターン化フローセルが使われています。たとえばNovaSeq 6000は、ナノウェルを持つパターン化フローセルを使い、1つのナノウェルに1つのクラスターだけができるように設計されています[6]。クラスターの位置があらかじめ決まっているので、画像の解析が単純になり、限られた面積により多くのクラスターを詰め込めます。

3. クラスター形成：ブリッジ増幅で同じ断片を増やす

クラスター形成とは、フローセルに結合した1本の断片を、その場で数百〜数千本の同じ断片に増やし、小さな集団（クラスター）を作る工程です。増やし方の代表がブリッジ増幅（ブリッジPCRとも呼ばれます）で、2008年の報告でもこの方法でクラスターが作られています[1]。

ブリッジ増幅の流れ

フローセルに結合した断片は、もう一方の端のアダプターが近くに固定された別のオリゴと相補的塩基対を作り、アーチ状に折れ曲がって「橋」をかけます。このオリゴを足場にポリメラーゼが相補鎖を合成し、2本鎖をほどくと、断片とその相補鎖がそれぞれ板に固定された状態になります。これを何十回も繰り返すと、最初の1本のまわりに同じ配列の断片が密集した集団ができます。最後に片方の向きの鎖を切り離して取り除き、同じ向きの1本鎖だけをそろえて、読み取りの準備が整います。

「次世代シーケンサーとPCRは何が違うのか」という疑問をよく見かけますが、ブリッジ増幅はPCRと同じく、プライマーを足場にポリメラーゼでDNAを増やす反応です。違いは目的と場所で、PCRは特定の領域を試験管の中で増やすのに対し、ブリッジ増幅はフローセルの上で、結合した断片それぞれをその位置のまま増やします。2008年の報告では、温度を上げ下げしない等温の条件でこの増幅が行われています[1]。パターン化フローセルでは、ナノウェルごとに1つのクラスターだけが育つよう工夫された別の増幅法（ExAmp）が使われています[6]。

なぜ増やす必要があるのか

理由は明るさです。1つの分子が出す蛍光はあまりに弱く、カメラでははっきり捉えられません。同じ配列の断片が数百〜数千本集まり、同じタイミングで同じ色に光ることで、はじめて読み取れる明るさになります。クラスターは、1本の断片の声を合唱にして聞き取りやすくする仕組みだと考えると分かりやすいと思います。

4. 合成しながら読む：SBS（シーケンシング・バイ・シンセシス）

SBS法とは、DNAを1塩基ずつ合成させながら、そのたびに取り込まれた塩基の色を撮影して配列を読む方法です。日本語では「合成によるシーケンス」とも呼ばれ、イルミナ方式の中心となる化学反応です[1]。

可逆的ターミネーターと蛍光標識

SBSで使う塩基（ヌクレオチド）には、2つの細工がされています。1つは塩基の種類ごとに異なる蛍光色素、もう1つは次の塩基がつながらないようにする「ふた」です。このふたは化学処理で外せるため、可逆的ターミネーターと呼ばれます[1]。

サンガー法でも、伸長を止める塩基に色をつけて読み取っていました。ただしサンガー法のふたは外せないため、止まった位置の違う多数の分子を長さ順に並べる必要がありました。SBSではふたを外して次に進めるので、同じ分子の上で1塩基ずつ、1回1回確かめながら読み進められます。

1塩基ずつ確実に止める仕組みには、もう1つ利点があります。AAAAのように同じ塩基が続く部分（ホモポリマー）でも、1サイクルに1塩基しか進まないので、続いた数を数え間違えにくいのです。同じ塩基が続く部分で数を読み違えやすいことは、ふたを使わずに塩基を流す方式では課題になりやすく、方式ごとの得意不得意の1つになっています[2]。

1サイクルの流れ

まず、アダプターの共通配列にシーケンシング用のプライマーが結合します。そこへポリメラーゼと4種類の標識塩基を流すと、各クラスターで鋳型に相補的な塩基が1つだけ取り込まれ、ふたがあるのでそこで止まります。余分な塩基を洗い流してから、フローセル全体を撮影します。続いて蛍光色素とふたを化学的に切り離し、次の塩基を受け入れられる状態に戻します。この「取り込み→撮影→切断」が1サイクルで、サイクルの回数がそのまま読み取れる長さ（リード長）になります。

4色と2色の読み取り

初期の装置では、A・C・G・Tの4種類にそれぞれ別の色をつけ、毎サイクル4枚の画像で見分けていました。新しい装置の多くは2色で読み取ります。NovaSeq 6000では、Tは緑、Cは赤、Aは赤と緑の両方で光り、Gは色素を持たず光りません[6]。赤と緑の2枚の画像だけで4種類を区別できるので、撮影と解析が速くなります。

この仕組みには1つ注意点があります。「光らない」がGを意味するため、クラスターの信号が弱まって光らなくなった場合にも、Gと判定されやすいのです。2色方式のデータでGが不自然に続く読み取りが見られることがあるのはこのためで、後の工程で品質を確かめる必要があります。

5. 画像から塩基へ：ベースコールと品質スコア

装置に組み込まれたソフトウェアが、各クラスターの位置と色を全サイクルにわたって追いかけ、A・C・G・Tの文字列に置き換えます。この工程をベースコールと呼び、1塩基ごとにその判定の確かさを示す品質スコアがつきます。読み取った配列と品質スコアは、FASTQ（ファストキュー）と呼ばれる形式のファイルに、1本の断片ごとに書き出されます。

フェージング：足並みのずれが読み間違いを生む

クラスターの中の数百〜数千本の断片は、理想的には毎サイクルそろって1塩基ずつ進みます。しかし実際には、ふたが外れずに1サイクル遅れる分子や、ふたのない塩基が混ざって先に進んでしまう分子が少しずつ出てきます。この足並みのずれ（フェージング）がサイクルを重ねるごとにたまると、クラスターの光は混ざった色になり、どの塩基かの判定が難しくなります。リードの後半ほど品質が下がりやすいのはこのためです。

品質スコア（Q30の意味）

品質スコアは、もとはサンガー法の波形を解析するソフトウェアPhred（フレッド）のために考えられた尺度で、読み間違いの確率をPとしたとき「Q = −10 × log10(P)」で表します[7]。数字が10増えるごとに、読み間違いの確率は10分の1になります。

次世代シーケンスでは、Q30が品質の目安として広く使われています[8]。品質スコアが低い塩基やリードは、後の解析で除外したり重みを下げたりします。1塩基の読み間違いが診断を左右する遺伝子検査では、この品質管理がとくに重要になります。

NIPTの方式によって、品質スコアの重みは変わります。染色体ごとのリードの数を数える全ゲノム方式では、リードがゲノムの正しい位置に当てはまりさえすれば、途中に1塩基の読み間違いがあっても数え方にはほとんど影響しません。一方、一塩基多型（SNP）の部位を狙って、母親由来と胎児由来の型の比率を測る方式では、1塩基の読み違いがそのまま比率のずれになります。このため、SNPを使う方式では品質スコアを考慮した解析が性能の向上につながりうるとされています。方式の違いについては、SNPベースのNIPTのページで詳しく扱っています。

6. リード長・シングルエンド・ペアエンド・インデックス

リード長はシーケンスのサイクル数で決まり、断片の片端だけを読むのがシングルエンド、両端を読むのがペアエンドです。検体ごとの目印であるインデックス配列も、本体とは別に短く読み取ります。

ポリメラーゼはDNAを決まった一方向にしか伸ばせないため、1回の読み取りで読めるのは断片の一方の端からです。ペアエンドでは、1回目の読み取りが終わったあと、もう一度ブリッジ増幅で相補鎖を作り直し、最初の鎖を取り除いてから、反対側の端から2回目の読み取りを行います。両端の配列が分かると、ゲノムのどこに当てはまるかを決めやすくなるうえ、2つの端の位置の差から断片のもとの長さも分かります[1]。胎盤に由来する断片は短い傾向があるため、断片の長さはNIPTで胎盤由来DNAの割合を推定する手がかりにもなります[3]。

1本あたり数十〜数百塩基を読むこの方式は、ショートリードシーケンサーに分類されます。1つのフローセルからは1検体には多すぎる量のリードが得られるため、通常は多数の検体を混ぜて一度に読み、インデックス配列を手がかりに後から検体ごとに振り分けます。この振り分け（デマルチプレックス）と、読んだ断片をゲノム上の位置に当てはめる工程（アライメント）は、次のページのシークエンサーのあと：デマルチプレックスとアライメントで扱います。

インデックス配列は、本体の配列とは別に、数塩基から十数塩基ほどの短い読み取りとして取得されます。装置は本体の配列のファイルとインデックスのファイルを別々に出力し、どの行どうしが同じクラスターに由来するかを対応づけて記録します。インデックスには互いに十分に異なる配列が選ばれているため、1塩基程度の読み違いがあっても、どの検体のものかを取り違えずに済むよう工夫されています。

7. NIPTではシーケンサーをどう使うか

一般的な遺伝子検査では、シーケンサーは「配列の中の1文字の違い」を探すために使われます。NIPTでは、使い方がまったく違います。目的は配列の細部ではなく、「どの染色体から来た断片が何本あるか」を数えることです。このため、NIPTは遺伝子検査というより、DNA断片の計数検査と考えると本質がつかみやすくなります。

配列そのものより「どの染色体の断片か」を数える

全ゲノムを対象とする方式のNIPTでは、読み取ったリードをゲノム上の位置に当てはめ、染色体ごとのリードの本数を数えます。胎児が21トリソミーなら、胎盤から出た21番染色体の断片がわずかに多くなるため、21番染色体に当てはまるリードの割合がごく少しだけ増えます。この増え方を、正常な妊娠の検体の分布と比べて判定します[4][5]。リードの数を区間ごとに数えて比べる具体的な方法は、WGSベースのNIPT①：リードの密度とは？から始まる第3章で説明しています。

この目的なら、リードはゲノム上の位置を1か所に決められる長さがあれば足ります。初期のNIPTの研究で使われたリードも数十塩基の短いものでした[4][5]。サイクル数が少なければ、検査にかかる時間も費用も小さくなります。NIPTで短いリードが選ばれるのは、精度を犠牲にしているからではなく、目的に対してそれで十分だからです。

ゲノム全体を浅く読めば足りる理由

一般的な全ゲノム解析では、同じ位置を30回以上重ねて読むことが目安になります。NIPTはその逆で、ゲノムの1か所1か所は平均すると1回も読まれないほど浅く読みます。2×35塩基のペアエンドで1検体あたり1,600万〜2,000万リードを読んだ報告では、ゲノム全体のおよそ0.35倍の深さでした[9]。この研究は微細な欠失まで調べるためのもので、読む量はこの目的に合わせて多めに設定されています。浅く読む考え方は低カバレッジ全ゲノム（低深度WGS）、深さの考え方はシーケンス深度（リード深度）のページで解説しています。

それでも判定できるのは、数えているのが1か所ではなく染色体全体だからです。21番染色体はゲノム全体の約1.5%を占めるので、1,000万本のリードがあれば、21番染色体に当てはまるリードだけで十数万本になります。これだけの数があれば、わずかな増加も統計的に見分けられます。ただし、検出できるかどうかは読む量だけで決まるわけではありません。胎盤由来DNAの割合である胎児分画が低いと、増え方そのものが小さくなり、読む量を増やしても見分けにくくなります。

1回の運転で多数の検体を読む

1枚のフローセルからは数億〜数十億本のリードが得られます。1検体に必要な量はその一部なので、インデックス配列で目印をつけた多数の検体を混ぜ、一度に読み取ります。これがNIPTの費用を下げている大きな理由の1つです。一方で、フローセルに流す量や検体の混ぜ方がうまくいかないと、一部の検体のリードが足りなくなり、再検査や判定保留につながることがあります。

判定保留の原因として最もよく知られているのは胎児分画の低さですが、シーケンスの工程に由来するものもあります。リードの総数が足りない場合のほか、同じ分子を何度も読んだ重複ばかりで実質的な情報量が少ない場合や、特定の領域に読み取りが偏った場合も、検査会社は品質基準を満たさないとして判定を出さないことがあります。判定保留は「異常がある」という意味ではなく、多くは「この検体では十分な確かさで数えられなかった」という意味です。

8. イルミナ方式以外の読み取り方式

NIPTに使われるシーケンサーはイルミナ方式が中心ですが、原理的には「多数のcfDNA断片がゲノムのどこから来たかを、十分な量、速く安く調べられる」方法であれば使うことができます。実際にいくつかの方式がNIPTに応用されています[2]。

半導体方式（イオントレント）は、光ではなく、塩基が取り込まれるときに放出される水素イオンによる小さなpHの変化を、半導体チップで電気的に検出します[10]。カメラを使わないため装置を小さくでき、この方式を使ったNIPTの報告もあります[11]。DNAナノボール方式は、環状にしたDNAを鎖のように長く複製して丸めた「ナノボール」を板の上に並べて読む方式で[12]、BGI/MGI系の装置に受け継がれています。

これらはいずれも短い断片を読むショートリード方式です。これに対して、1本の長いDNAを数万塩基以上つなげて読むロングリードシーケンサーもあり、代表が膜に埋め込んだ小さな穴をDNAが通るときの電流の変化で配列を読むナノポアシークエンサーです。cfDNAはもともと短い断片なので、長く読める利点は活かしにくい一方、断片の数を数える目的なら読み間違いの多さが問題になりにくい、という見方もあります。シーケンス以外の技術を含めたNIPTの方式は、NGS以外のNIPT技術で扱います。

よくある質問（FAQ）

9. まとめ

イルミナ方式の次世代シーケンサーは、DNA断片をフローセルに固定し、ブリッジ増幅でクラスターに増やし、可逆的ターミネーターをもつ蛍光標識塩基を1つずつ取り込ませて撮影することで、数億本の断片を同時に読み取ります[1]。読み取った塩基には品質スコアがつき、Q30なら読み間違いの確率は1,000分の1です[7][8]。

NIPTはこの装置を、配列の細部を読むためではなく、染色体ごとの断片の数を数えるために使っています。そのため短いリードでゲノム全体を浅く読めば足り、多数の検体を一度に読むことで費用を抑えています[4][9]。装置の仕組みを知っておくと、胎児分画や判定保留といったNIPTの結果にかかわる言葉の意味も、ずっと理解しやすくなります。

参考文献

• [1] Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008;456(7218):53-59. [DOI 10.1038/nature07517]
• [2] Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016;17(6):333-351. [PubMed 27184599]
• [3] Jiang P, Lo YMD. The long and short of circulating cell-free DNA and the ins and outs of molecular diagnostics. Trends Genet. 2016;32(6):360-371. [DOI 10.1016/j.tig.2016.03.009]
• [4] Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(42):16266-16271. [DOI 10.1073/pnas.0808319105]
• [5] Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(51):20458-20463. [PubMed 19073917; DOI 10.1073/pnas.0810641105]
• [6] Illumina. Chemistry and Imaging on NovaSeq 6000. Illumina Knowledge. [Illumina]
• [7] Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 1998;8(3):186-194. [Genome Research]
• [8] Illumina. Sequencing Quality Scores. [Illumina]
• [9] Kucharik M, Gnip A, Hyblova M, et al. Non-invasive prenatal testing (NIPT) by low coverage genomic sequencing: Detection limits of screened chromosomal microdeletions. PLoS One. 2020;15(8):e0238245. [DOI 10.1371/journal.pone.0238245]
• [10] Rothberg JM, et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature. 2011;475:348-352. [DOI 10.1038/nature10242]
• [11] Liao C, Yin AH, Peng CF, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(20):7415-7420. [DOI 10.1073/pnas.1321997111]
• [12] Drmanac R, et al. Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays. Science. 2010;327(5961):78-81. [DOI 10.1126/science.1181498]

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