PCR

PCRとは?

日本語では ポリメラーゼ連鎖反応 といいます。

英語では polymerase chain reaction といい、 PCR が略称です。

DNAを増やす(増幅といいます)ための手法で、PCR法と呼びます。

PCRの特徴

ヒトのゲノムには30億塩基対という非常におおきいDNA分子となっていあすが、そうした中から、自分の意図する特定のDNA断片(数百から数千塩基対)だけを選択的に増幅させることが可能であり、極めて微量なDNAを増幅することで測定できます。
増幅に要する時間も2時間程度と短く、プロセスは単純で、全自動の卓上型装置となっています。
PCR法から派生したものには
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
リアルタイムPCR
DNAシークエンシング
等の様々な技術があり、さまざまな分野の研究に応用されています。
また、微量のゲノムやRNAから目的のDNAを選択的に増幅して測定可能にすることができるため、DNA型鑑定や診断などを可能にした画期的な技術なのです。

PCRの原理

2本鎖DNAは、水溶液中で高温になると、変性し1本鎖DNAに分かれます。
変性が起こる温度は、DNAの塩基構成(塩基の種類)や長さ(塩基数)によって異なりますが、大体は長いDNAほど高い温度が必要になります。

熱変性によりして1本鎖DNAとなったDNA溶液を冷却していくと、相補的なDNAが互いに結合し再び2本鎖となります。
相補的なDNAが結合することをアニーリングといいます。
急速に冷却しても、長いDNA同士は2本鎖に再結合しにくいのですが、オリゴヌクレオチドとよばれる短いDNA断片は結合できます。
この性質を利用して、PCR法では増幅したい対象のテンプレートDNA、DNA合成酵素(DNAポリメラーゼ)、そしてプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチド(端っこにくっついてそこから増幅を始める役割をします)を予め混合し、前述の変性・アニーリングを行います。
わかりにくいのでこの辺で図を入れましょう。
pcr

こうして長い1本鎖DNAの一部にプライマーが結合した形ができます。

プライマーがDNAよりも圧倒的に多い状況にしておくことで、DNA-プライマーの結合がDNA-DNAの結合より、優先的されることになります。

この状態でDNAポリメラーゼ(DNAを伸長する酵素)が働いて、プライマーが結合した部分を起点として1本鎖部分と相補的なDNAがどんどん合成されます。

DNAが合成された後、また高温にしてDNAを変性させて1本鎖にして、同じ繰り返します。

これを35回繰り返すと2の35乗倍、つまり、34,359,738,368倍となるわけです。理論的には。

このように、PCR法は、DNAの長さの違いによる変性とアニーリングの違いを利用して、加熱と冷却を繰り返してDNA合成を繰り返し、DNAを増幅する技術なのです。

PCR法が開発されたばかりの当初は、DNAを変性させるときの加熱処理でDNAポリメラーゼが失活していたので、サイクル毎に酵素を追加して手間がかかりました、現在ではTaqポリメラーゼと呼ばれる熱に強い耐熱性DNAポリメラーゼが発見されて用いられることで連続して反応を進めることができるようになり、全自動で簡単になりました。

PCRの手順

1.増幅対象のDNA領域の両端の塩基配列を決定
2.対応するプライマーを合成。プライマーは、増幅予定の2本鎖DNAの両鎖それぞれの3’側に結合する相補配列であり、通常20塩基程度にします。
3.反応液調製します。
増幅対象DNA、プライマー、DNAポリメラーゼおよびDNA合成の材料(基質)となるデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、そして酵素が働くためのバッファー溶液を混合し、PCR装置にセットする。
4.PCRサイクル

この記事の著者:仲田洋美医師
医籍登録番号 第371210号
日本内科学会 総合内科専門医 第7900号
日本臨床腫瘍学会 がん薬物療法専門医 第1000001号
臨床遺伝専門医制度委員会認定 臨床遺伝専門医 第755号