MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法

MLPAとは?

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)は、単一のPCRプライマー対を用いて1回のPCR反応を行うことで、最大60個の特定核酸配列の異常コピー数を検出する方法です。MLPA反応に必要なDNA量は50ng。
用途としては、遺伝子エクソン単位の欠失/重複の検出、ダウン症などのトリソミーの検出、細胞株や腫瘍サンプルにおける染色体異常の特徴付け、SNP突然変異の検出、DNAメチル化分析などが挙げられます。MLPAの最大の用途は、コピーナンバーの変動に起因する疾患の検出です。コピーナンバー・バリエーション(CNV)とは、DNAの特定の部分のコピーが欠失したり、繰り返したりしているものです。遺伝性疾患のうち、CNVに起因する疾患は最大10%を占めています。
遺伝子型が疾患の観察された表現型とどのように相関しているかを決定するためには、どのような遺伝子の複製/欠失が起こったかを正確に決定することが重要となります。例えば、DMD遺伝子の完全欠失はデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)を、部分欠失はベッカー型筋ジストロフィー(BMD)を引き起こすという風に、同じ遺伝子でも変異の仕方により表現型(現れる疾患、症状)は違うのです。

MLPAの検出できるDNA変異の大きさ

塩基対の数と検出方法

DNA検査方法と検出可能なサイズ

この図は、ゲノム解析の解像度と使用する検査方法の関係を示したものです。
G分染法では400~500バンドレベルの日常精度で5~15Mb (Mは100万)、850バンドを染め分けることができる高精度分染法でも1~3Mbです。これに対してMLPAは1~10Mbと幅広い大きさのものを検出するのに適しています。

従来法のマルチプレックスPCRとの違い

従来のマルチプレックスPCRでは、各フラグメントに対して1対のプライマーを使用するため、多数の異なるプライマーセットに対する反応が生じます。また、プライマーごとのプライマー効率が異なるため、従来のマルチプレックスPCRでは標的配列の相対定量が困難でした。さらに、反応条件の小さな違いは、各プライマーペアが変化に対してわずかに異なる反応を示すことがあるため、得られる結果に大きな違いが生じる可能性があります。

これに対し、MLPA反応では、すべての断片が同じPCRプライマーペアを用いて増幅されるため、反応は極めて厳格なものとなります。MLPAでは、増幅されるのはサンプルDNAではなく、サンプルに添加されるMLPAプローブであることが大きな特徴です。各MLPAプローブは2つの対のオリゴヌクレオチドで構成されており、それぞれにPCRプライマー配列の1つとDNA標的配列に相補的な配列が含まれています。これら2つのプローブオリゴヌクレオチドは、すぐに隣接する標的部位にハイブリダイズします。2つのプローブオリゴヌクレオチドが標的部位にハイブリダイズして初めて、フォワードプライマー配列とリバースプライマー配列の両方を含む1つのプローブにライゲーションすることができます。これらのライゲーションされたプローブは、PCR反応中に指数関数的に増幅されますが、ライゲーションされていない個々のプローブオリゴヌクレオチドは増幅されません。したがって、1つのプローブのプローブライゲーション産物の数は、サンプル中の標的配列の数に依存するのです。
PCR後、得られた増幅産物はキャピラリー電気泳動により分離されます。MLPAプローブセットは、それぞれの増幅産物の長さが固有の値になるように設計されています。その長さは段階的に増加し、総サイズは120~500ヌクレオチドです。

マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法(MLPA)の利点

マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法(MLPA)は、様々な疾患に関連する特定の遺伝子の重複や欠失の特徴を正確に記述するために使用される技術です。コピーナンバーバリアントCNVを検出するためにMLPAを使用すると、サザンブロットやFISHなどの他の技術に比べていくつかの利点があります。

1ヌクレオチドの違いで異なる2つの配列を識別できます

遺伝子欠失・重複の特異的ブレークポイント部位の特性評価
通常、他の方法では検出できないような小さな単一の遺伝子異常の同定。
高スループットと低入力
また、MLPAは、DNAのメチル化状態や一塩基多型(SNP)の存在を検出し、特徴付けることができます。

MLPAの検査プロセス

MLPAを行うために必要な装置は、キャピラリー電気泳動装置とサーモサイクラーのみである。非標識オリゴヌクレオチドを除去する必要がないため、1本のチューブでMLPA反応を行うことができます。
MLPA プロセスには、変性、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、増幅、フラグメント分離、データ解析の 5 つのステップがあります。

反応混合物は、調査対象のDNAサンプルとともに、特定のDNA配列に特異的な最大40個のプローブで構成されています。各プローブは2つのハーフプローブ(それぞれ5′と3′)で構成されています。

プローブは、標的特異的配列と、DNAサンプル内の複数のDNA標的配列の増幅が同時に起こることを可能にするユニバーサルプライマー配列を含むDNAの短い配列です。スタッター配列と呼ばれる付加的な特徴は、標的DNAの特定のセクションのコピーである異なるサイズの増幅産物の生成を可能にする。

MLPAのプロセスは以下の通りです。

1. 1.変性。98 °C の温度で加熱することにより、DNA の 2 本の鎖が分離されます。

2. ハイブリダイゼーション MLPAプローブは、変性したDNAサンプルに加えられ、標的配列と結合します。2 つのプローブは、DNA の標的配列の隣接する部位に結合します。これをハイブリダイゼーションといいます。

3. ライゲーション。ハイブリダイゼーションしたプローブを含む DNA 標的配列は、リガーゼと呼ばれる酵素によってライゲーション(結合)されます。このライゲーションの段階では、ハイブリダイゼーションが特異的であったかどうかを確認することができます。プローブと標的配列の間にミスマッチがあると、増幅が起こらなくなります。

4. 増幅。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、プローブでライゲーションされた標的配列をコピーするために使用される。これには、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、フォワードプライマーとリバースプライマーの添加が必要です。フォワードプライマーは蛍光プローブで標識されており、DNAコピー数を測定できるようになっています。MLPAの重要な特徴の一つは、ライゲーションされたプローブのみが増幅されることです。

5. フラグメントの分離 増幅された断片は、キャピラリー電気泳動を用いて、その長さに応じて分離されます。各フラグメントは、電気泳動と呼ばれる明瞭なピークパターンとして可視化されます。フラグメントの予測される長さは、各プローブ上のスタッター配列の長さと、隣接するプローブ間に介在する配列の長さに応じて計算することができます。

6. データ解析を行う。DNAサンプルから得られたデータを参照サンプルのセットと比較し、遺伝子のコピー数を明らかにするプローブ比を算出する。例えば、ほとんどの正常な遺伝子のコピー数は2で、各染色体ペアからのコピー数は1となります。 1以下の比率は欠失を示し、1を超える比率は遺伝子の重複を示唆しています。

弱いプローブ信号は、プローブによって検出された配列の変化によっても引き起こされる可能性があることに注意することが重要である。変化がライゲーション部位に隣接している場合は、2つのプローブのライゲーションを防ぐことができます。

さらに離れた場所(ライゲーション部位から最大20ヌクレオチド)で配列変化がある場合は、プローブのハイブリダイゼーションが不安定になる可能性があるため、低いプローブ信号が発生する可能性があります。1 つのプローブで検出されたコピー数の変化は、必ず別の方法(通常はシーケンス、長距離 PCR、または qPCR)で確認する必要があります。

MLPAのプロセス

MLPAのバリエーション

MLPAには、逆転写酵素MLPA(RT-MLPA)やメチル化特異的MLPA(MS-MLPA)などのバリエーションが開発されています。

逆転写酵素MLPA(RT-MLPA)

RT-MLPAはmRNA分子の解析に用いられます。リガーゼはDNAに結合したプローブをライゲーションすることができないため、RNAを逆転写して相補的なDNA(cDNA)を得る必要がありますが、これはリガーゼが作用させることができます。それ以外の手順は標準的なMLPAと同じです。

DNAのメチル化を検出

DNAのメチル化を検出することは、遺伝子に関する重要な情報を明らかにするために重要です。まず、プロモーター領域がメチル化されている場合は、「サイレンシングされた」遺伝子であることを示しています。

がん抑制遺伝子のサイレンシングをDNAメチル化で検出

サイレンシングされた遺伝子は診断ツールとして使用することができます。例えば、腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングは、癌の特徴である制御されない細胞増殖をもたらします。

MS-MLPA:ゲノムインプリンティングをDNAメチル化で検出

また、メチル化はゲノムインプリンティングにおいて重要となります。
コピー数の解析とメチル化解析が同時に可能なMS-MLPAは欠失やメチル化異常が原因となる疾患の診断に用いられています。
1組の染色体には、メチル化パターンに依存する方法で発現が異なる遺伝子があります。これらのメチル化パターンを検出することで、どの親染色体がその遺伝子を発現しているかを特定することができます。
MS-MLPAプロトコルは、標準的なMLPAとは異なり、各反応でキャピラリー電気泳動分析用の2つの異なるサンプルが生成されます。1つは、コピー数の変化を報告するための標準的なMLPA反応として処理され、もう1つは、プローブが同時にライゲーションされている間に、メチル化感受性のHhaIエンドヌクレアーゼでインキュベートされます。

塩基対の数と検出方法

この図は、ゲノム解析の解像度と使用する検査方法の関係を示したものです。
G分染法では400~500バンドレベルの日常精度で5~15Mb (Mは100万)、850の高精度分染法でも1~3Mbです。これに対してFISHは10K~10Mbの大きさのものを検出するのに適しています。
マイクロアレイはさらに小さな1Kb~を分析することが可能です。

染色体マイクロアレイ技術では1つのプローブが示す場所を細胞内や染色体上で確認する代わりにオーバーラップさせたり規則的な間隔をあけたりしてゲノム全体に対応させたDNA断片を顕微鏡スライド上に配置したアレイを用いて1度の解析で全ゲノムを対象にコピー数についての検索を行うことが可能です。

比較ゲノムハイプリダイゼーション(アレイCGH)

マイクロアレイ法の1つのアプローチである比較ゲノムハイプリダイゼーション(comparativegenome hybridization :CGH)法は、対照のゲノムと患者から得たゲノムの2種類をマイクロアレイに同時にハイブリダイズし、相対的なコピー数の増加や減少をゲノムワイドに検出する方法です。
どちらかのゲノムの配列が過剰にあるということは、患者ゲノムを対照と比較したときに、それらの配列の増加あるいは減少があることを示しています。

マイクロアレイ染色体検査の模式図です。
A:比較ゲノムハイプリダイゼーション(CGH)に基づくアレイ解析の概略図。
患者ゲノムを緑色対照参照ゲノムを赤色蛍光色素でそれぞれ標識したものを混合して選択したプラットフォームのアレイ上に播種します。アレイ上のプローブDNAにハイブリダイズさせる。相対的蛍光強度を測定し、患者ゲノムと参照ゲノムが等量であれば黄色、患者ゲノムが増加(gain)していれば緑色減少(loss)していれば赤色に検出される。

B:Aの結果の出カイメージ。黄色に検出されたlog2比0付近のプロットが連続している領域は、患者のその領域のゲノムコピー数がリファレンスと等量(すなわち2コピー)であることを示しています。
緑色に検出されたプロットが連続している領域はコピー数増加を赤色に検出されたプロットが連続している領域はコピー数減少を示しています。
C : MECP2遺伝子を含むXq28バンド内の約800kbの重複を示しています。 Rett症候群患者のCGHアレイの結果例。蛍光比のlogRをX染色体の全長に沿って描画した。各点はアレイ上の個々のプローブにおける比を示している。患者ゲノムではMECP2遺伝子とその周りの領域に対応する配列が増加していて、その比(ゲノムコピー数)が増加している(緑色の矢印).増加した領域は緑色で示されている。

SNPアレイを用いる方法

SNPアレイにはゲノム全体にあるさまざまな一塩基多型の2つのアレルに対応する配列が含まれる。この方法では、ゲノム中の異なる領域のアレルの相対的な量と強度が得られ、特定の染色体や染色体領域が適当な量だけ存在しているかどうかを示す。
染色体異常が疑われる場合の日常的な臨床検査では、アレイのプローブ間隔がヒトゲノムのユニーク領域全体で250kb程度の精度である。つまり、大きなものをおおざっぱに検出するのであるからプローブも大きくていいということです。
責任領域がわかっている成長障害や先天異常など、特に臨床的関心のある領域についてはより高密度のプローブを使って、より高い精度(く25-50kb)で実施する必要があるのですが、小さい断片に対応することも可能です。

マイクロアレイの限界

1.この検出方法は、あるDNA配列の相対的コピー数を測定しているにすぎないため、それらが転座したり再構成したりしているかどうかは検出できません。したがって、マイクロアレイで疑われた染色体やゲノムの異常を、核型分析や分裂像のFISH解析によって確認し、異常の性質と家系での再発率を確定することが必要となります。

2.高解像度のゲノム解析は、臨床的意義が明らかになっていないコピー数のわずかな違いなどのバリアントの存在を明らかにしてしまうことです。
これらの多くは無害なコピー数バリアント(copynumber variant : CNV)なのですが、診断に関して、何が正常な染色体構成で、何が病気の原因となるバリアントなのかという評価方法の確立が重要なり、課題となっています。

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この記事の筆者

1995年医師免許取得。血液・呼吸器・感染症内科を経て、臓器別・疾患別の縦割りの医療の在り方に疑問を感じ、人を人として”全人的”に診療したいという思いを強くし、臓器を網羅した横断的専門医となり、2010年にがん薬物療法専門医取得(2019年現在全国1200人程度)。臓器を網羅すると遺伝性がんへの対策が必要と気づき、2011年に臨床遺伝専門医取得(2019年現在全国1000人程度)。遺伝相談はセンシティブな分野にもかかわらず、昼間の短い時間しか対応できない大病院のありかたに疑問を感じて、もっと必要な人がハードルを感じずに診療を受けられるようにしたいと2014年12月に開業。以来、全国から大学病院でも難しい内容の対応を求める人々を受け入れ、よろづお悩み相談所として多くの人々の様々な”家族(計画)の問題”を改善に導く。

著書に”女性のがんの本当の話”(ワニブックス)、”遺伝するがん・しないがん”(法研)がある。
少ない専門家で、正直で嘘のない言葉選びから週刊誌等の取材も多く、医療系の特集に時折コメントが掲載。(週刊現代、週刊ポスト、週刊新潮など)。
テレビ出演も時々あり、小林真央さんの病状を市川海老蔵さんが初めて記者会見した日、フジテレビの午後4時台のニュース番組に生出演して解説。その他TBS, AbemaTVなど出演。

一人一人の事情に合わせた個別対応をするべく、しっかり時間を取って本当のニーズは何かを聞き取りすることを大切にしている。短い時間でもお互いが出会ったことが相手の人生に大きな意味があるような医師患者関係の構築を理想として日々精進。

患者さんが抱えている問題を解決するにはどうしたらよいのかを考えて医師歴8年目に法学部に学士入学した程度に”凝り性”。女医が少なかった時代に3人の母親として難関専門医を3つ取得して社会進出を続けた経験から、女性のライフスタイルを医学以外の部分でも支援したいと願っている。
いろんな人生経験から心に響く言葉を投げかけるため、”会うと元気になる”ということで有名。飼いネコ3匹。

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