WGSベースのNIPT③：平均ビン値とGCバイアス補正｜誤差を減らす4つのしくみ

GCバイアスとは、DNA断片に含まれるG（グアニン）とC（シトシン）の割合、つまりGC含量によって、シークエンサーでの読まれやすさが変わってしまう偏りのことです。全ゲノムを読むタイプのNIPT（WGS法）は、ゲノムを細かな区画（ビン）に分け、ビンごとのリード数を平均して「その染色体がどれだけあるか」を測ります。この平均ビン値には必ず誤差があり、GCバイアスや読み取りの重複などの偏りを取り除かないと、誤差が大きくなってトリソミーを見逃したり、正常なのに陽性と判定したりする原因になります。このページでは、平均ビン値の誤差がどのように決まるのかを数式と計算例で示したうえで、誤差を減らすための4つのしくみ（GC補正、マッパビリティ補正、系統的な偏りの正規化、中央値と四分位範囲による頑健な平均）を順に解説します。

1. 平均ビン値とは：リード数を「染色体の量」に変える

平均ビン値とは、ゲノムを同じ長さの区画（ビン）に分け、ビンごとに数えたリード数を、調べたい染色体や領域の中で平均した値です。WGS法のNIPTでは、母体の血液に含まれるDNA断片を数百万〜数千万本読み取り、1本1本がゲノムのどこから来たかを決めて、ビンごとに本数を数えます。染色体によって長さが違うため、総リード数をそのまま比べることはできません。そこで、長さの影響を除いた「1ビンあたりのリード数」に直して比べます。この考え方はリードの密度のページで解説しました。

母体の血液の中を流れているDNA断片（セルフリーDNA）は、主に母親の血液細胞と胎盤の細胞がアポトーシス（あらかじめ決められた細胞死）を起こすときに出てくるものです。胎児がトリソミー21であれば、胎盤から来た断片の中で21番染色体の断片が1.5倍になり、母親と胎盤を合わせた全体では、21番染色体の平均ビン値がわずかに高くなります。NIPTは、このわずかな上昇を誤差と区別して見つけ出す検査です。

NIPTは「標本調査」である

WGS法のNIPTは、母体の血液に含まれるDNA断片の一部を取り出して数える「標本調査」です。選挙の出口調査が投票者全員ではなく一部の人に聞いて全体を推定するのと同じで、シークエンサーが読むのは血液中の断片のごく一部にすぎません。そもそも血液中の断片自体も、体の中で起きている細胞死の一部を映したものです。

標本調査には、必ず「たまたまの誤差」がつきまといます。同じ検体を2回読んでも、各ビンに入るリード数は毎回少しずつ違います。観察された平均ビン値と、本当は直接見ることのできない真の値との差が大きすぎると、正常な検体がトリソミーのように見えたり、トリソミーの検体が正常に見えたりします。そのため、WGS法のアルゴリズムの工夫は、ほとんどがこの誤差をどう小さくするかに向けられています。

誤差は標準誤差σ/√Nで決まる

平均ビン値の誤差の大きさは、標準誤差（SE）という量で表され、ビン同士が独立で同じ分散を持つ場合、算術平均についてSE＝σ/√Nとなります。σ（シグマ）はビンごとのリード数のばらつき（標準偏差）、Nは平均に使ったビンの数です。

Nは、染色体の長さと、選んだビンの大きさで決まります。たとえば21番染色体のうち配列が読める部分を約3,500万塩基とし、5万塩基のビンに分けると、Nはおよそ700個になります。ビンの大きさをどう決めるかはビンの最適サイズのページで扱いましたが、一度決めてしまえばNは染色体ごとに一定の数です。つまり、平均ビン値の誤差を左右できるのはσのほうです。WGS法のアルゴリズムの目標は、σを余分に大きくしている原因を一つずつ取り除き、σを理論上の下限に近づけることだと言いかえられます。

理論上の下限はポアソン分布で決まる

偏りがまったくない理想的な状態でも、σはゼロにはならず、ポアソン分布で決まる下限σ≒√（1ビンあたりの平均リード数）が残ります。ポアソン分布は、一定の確率でまれに起こる出来事を数えたときの散らばりを表す分布で、平均がλ（ラムダ）回なら、散らばりの標準偏差は√λになります。2010年の研究は、母体血漿のショットガンシークエンス（全ゲノムをまんべんなく読む方法）によるトリソミーの検出感度は、原理的にはこの数え上げの統計だけで決まることを示しました[1]。

実際の数で考えてみます。ここでは、1検体で約1,000万本のリードを読み、5万塩基のビンを使う場合を想定します。数値は計算のしくみを示すための例で、実際の検査ごとの値ではありません。

1ビンだけを見ると、ばらつきは約8%もあります。胎児ゲノム率4%のトリソミーの信号（約2%）より大きいため、1ビンでは何も判断できません。ところが700個のビンを平均すると、誤差は約0.3%まで小さくなり、2%の上昇を誤差の約7倍の大きさとして区別できる計算になります。ただし、独立な生リード数の理想化した例であり、実際の臨床検査のZスコアや感度を直接示す値ではありません。

一方、偏りのせいでσが下限の3倍に膨らんでいると、同じ2%の上昇も誤差の約2倍にしかなりません。一般的な判定の目安とされる「誤差の3倍」に届かず、見逃しにつながります。正常な参照検体における変動に対して、観測値が期待値から何標準偏差離れているかを表す数がZスコアで、その判定の考え方はZスコアとはのページで解説します。リード数を増やせばλが大きくなり誤差は下がりますが（シーケンス深度）、費用も増えます。リード数を増やす前に、まずσを余分に膨らませている偏りを取り除くことが大切です。

余分なばらつきを減らす4つのしくみ

実際のシークエンスデータには、ポアソン分布の下限を超えてσを膨らませる偏りがいくつもあり、WGS法のNIPTでは主に4つの処理でそれを減らします。処理の順番は、原因が分かっている偏りから先に取り除き、最後に残った外れ値に強い計算で平均をとる、という流れです。

2. GCバイアスとは：GC含量で読まれやすさが変わる

GCバイアスとは、DNA断片のGC含量によって、シークエンスで読み取られる効率が変わってしまう偏りです。WGS法のNIPTは、ゲノム全体からまんべんなくリードが得られることを前提にしています。しかし実際のリードの分布は均一ではなく、その一部はGC含量と関係しています。GC含量が平均的な断片はよく読まれ、極端に高い断片や低い断片は、期待される数より少なく読まれます[4][5]。

GC含量とは

GC含量とは、DNAの塩基配列のうち、G（グアニン）とC（シトシン）が占める割合のことです。DNAはA（アデニン）、T（チミン）、G、Cの4種類の塩基でできています。たとえば10塩基の配列「ATGCGCATTA」には、GとCが合わせて4個含まれるので、GC含量は40%です。ヒトゲノム全体の平均のGC含量は約41%で、場所によって30%台の領域から60%を超える領域まで幅があります[2]。

GC含量は染色体によっても違います。13番染色体や18番染色体はGC含量が低めの染色体で、19番染色体や22番染色体はGC含量が高めの染色体です。このため、GCバイアスが補正されないままだと、染色体ごとに測定のしやすさが違ってきます。

なぜGC含量で読まれやすさが変わるのか

GCバイアスの背景には、GC含量によってDNAの熱安定性や反応効率が変わることがあります。相補的塩基対のページで解説したとおり、G-Cの塩基対には3本、A-Tには2本の水素結合があり、塩基同士の積み重なり（スタッキング）も安定性に寄与するため、GC含量が高い断片は二本鎖がほどけにくく、GC含量が低い断片は逆にほどけやすく不安定です。DNAを増やしたり読み取ったりする反応は、二本鎖をほどいてから進むため、この熱力学的な違いが反応の効率の差になります。

偏りが入りこむ工程は一つではありません。DNAの抽出、シークエンサーにかけるためのライブラリー調製、そしてシークエンスそのものの、どの段階でもGCバイアスは生じえます。2011年の研究は、イルミナ社のシークエンスで見られるGC含量の偏りの大きな部分が、ライブラリー調製の際のPCR増幅で生じることを示しました[3]。GC含量が極端な断片がPCRで増えにくいことは、実験の現場でもよく知られた問題です（GCリッチ領域のPCR増幅）。

血漿中のセルフリーDNAに特有の事情もあります。2014年の研究では、母体血漿DNAのリードはGC含量40〜50%付近で最も多く、極端な値で少なくなる山型の分布を示しました。さらに、断片の切れ目の配列の種類によってGC含量の山の位置がずれることも報告され、血漿DNAがどこで切れているかという生物学的な性質も、見かけのGCバイアスに影響していると考えられています[5]。

重要なのは、GCバイアスの程度が検体ごと、検査の回ごとに違うことです[4]。すべての検体で同じだけ偏っているのなら、検体同士を比べるときに偏りは打ち消し合います。ところが実際には、ある検体ではGC含量の低い断片が強く減り、別の検体ではあまり減らない、といった違いが生じます。この「検体間の差」が、ポアソン分布の下限を超えてσを膨らませます。

GCバイアス補正のしかた：計算例

GCバイアスの補正は、検体ごとに「GC含量ごとの読み取り効率」を測り、観察されたリード数に効率の逆数を掛ける方法などで行います。手順は次の3段階です[4]。

たとえば、GC含量20%の断片が、平均的な断片に比べて50%の相対効率でしか読まれていないと分かったとします。この場合、GC含量20%の断片から得られたリード1本1本を、1÷0.5＝2倍に数え直します。GC含量45%付近の断片の相対効率が1.0なら、そのまま1倍です。

図1　GC含量と読み取り効率の関係（模式図）。横軸は断片のGC含量（%）、縦軸は平均的な断片を1.0としたときの相対効率です。緑の帯（40〜60%）付近がよく読まれ、GC含量20%で効率0.5なら、その断片のリードは2倍に数え直します。実際の曲線の形は検体ごとに異なります。

この補正をビンに当てはめると、次のようになります。GC含量が低めのビンAに120本のリードが入っていて、そのビンの断片の平均的な相対効率が0.75だったとすると、補正後は120÷0.75＝160本です。GC含量が平均的なビンBに160本入っていて相対効率が1.0なら、160本のままです。補正前はビンAが25%少なく見えていましたが、補正後は2つのビンが同じ値にそろい、ビンごとのばらつきσが小さくなります。

効率の曲線を求める方法には、GC含量ごとの比をなめらかな曲線で近似する方法（LOESS回帰など）がよく使われます。2011年の研究では、GC含量に基づく補正を加えることで、GC含量が低めの13番染色体と18番染色体のトリソミーを、21番染色体と同じように検出しやすくなることが示されました[6]。その後も補正の方法は改良が続いており、2023年の研究では、ビン単位ではなく断片1本ごとに、長さとGC含量の組み合わせに応じた重みを付けて補正する方法が報告されています[7]。

3. マッパビリティ：同じ配列が繰り返される領域の補正

マッパビリティ（mappability、配置可能性）とは、ある長さのリードが、ゲノム上のただ1か所に迷わず配置できるかどうかを表す指標です。読み取ったリードは、アライメントという処理で参照ゲノムと照らし合わせ、どこから来た断片かを決めます。ところが、ゲノムには同じ配列やよく似た配列が何度も繰り返される領域があり、そこから来たリードは、どの場所に置くべきかを決められません[8]。

同じ配列が多い場所で何が起こるか

重複の多い領域を放置すると、本来は何千か所から来たリードが1つのビンに積み上がり、そのビンだけ極端に多く、他のビンは少なく見えるという偏りが生じます。代表的な例がAlu配列です。Alu配列は約300塩基の繰り返し配列で、ヒトゲノムの中に100万コピー以上、ゲノム全体の約1割を占めています[2]。

NIPTでは短いリードが使われ、長さは装置や解析法によって異なります。リード全体が繰り返し配列の中に収まってしまうと、どのコピーから来たのかを配列だけで見分けることはできません。アライメントのソフトがそうしたリードを1か所にまとめて置いてしまうと、そのビンのリード数は跳ね上がり、本来そのリードが入るはずだった多くのビンでは逆にリード数が下がります。どちらも、ビンごとのばらつきσを膨らませ、平均ビン値の精度を下げます。

補正のしかた：マスクして逆数で割り戻す

マッパビリティへの対応の一例は、配置が曖昧な領域を集計から外し（マスク）、ビン内の一意に配置可能なリード開始位置の割合でリード数を割り戻す方法です。低マッパビリティのビン全体を除外する方法もあり、すべての検査が同じ補正を行うわけではありません。重複領域に配置されたリードは、ビンの合計に数えません。そのぶんリード数は減るので、ビンの中で「迷わず配置できる塩基」の割合で割り戻して、他のビンと比べられるようにします。

マッパビリティは、リードの長さによって変わります。リードが長いほど、繰り返し配列の外側の固有の配列まで含みやすくなり、配置できる場所が増えるからです。2012年には、ゲノム全体のマッパビリティをリードの長さごとに高速で計算する方法が報告され[8]、2018年には、リードの長さごとに「その位置から始まるリードが一意に配置できるか」を一塩基単位で示すデータが公開されています[9]。

マッパビリティとは別に、どの検体でも異常にリードが集まりやすい「問題のある領域」をまとめたリストも作られており、2019年に報告されたENCODEブラックリストは、解析から除外すべき領域の標準的なリストとして広く使われています[10]。さらに、2022年には、それまでの参照ゲノムで空白になっていた繰り返し配列の多い領域まで埋めた、常染色体とX染色体をほぼ隙間なく解読したヒトゲノム配列（T2T-CHM13；この報告にはY染色体は含まれません）が報告されました[11]。参照ゲノムの欠落が減れば配置を改善できる場合がありますが、短いリードでは反復配列の曖昧さが残るため、今後のNIPTの解析にも影響しうる進歩です。

4. 原因が分からなくても再現する偏りの正規化

GC含量やマッパビリティでは説明できない偏りでも、どの検体でも同じように現れる「系統的な」偏りであれば、正規化という処理で取り除くことができます。たとえば、あるビンがどの検体でも決まって他のビンよりリードが多く、その理由がはっきりしない、という場合です。原因が分からないからといってそのビンを捨ててしまうと、使えるビンの数Nが減り、標準誤差σ/√Nがかえって大きくなります。

多数の検体の中央値で割り戻す

最も単純な正規化は、多数の検体でそのビンのリード数の中央値を求め、その値を基準にすべての検体のビンを補正する方法です。大きな集団の真ん中にいる検体は、その染色体が2本（ダイソミー）であると考えてよいため、中央値はそのビンの「正常な状態での値」とみなせます。

たとえば、ビンXが多数の検体でいつも平均より8%多く読まれているとします。基準となる中央値は1.08です。ある検体でビンXが1.08だったなら、1.08÷1.08＝1.00に直します。こうすると、ビンXがもともと持っていた「8%多く読まれやすい」という癖が取り除かれ、検体に固有の変化だけが残ります。この処理を外れ値かどうかにかかわらずすべてのビンに行うことで、データ全体の系統的なばらつきが減り、σが小さくなります。

主成分を取り除く方法

より高度な方法として、多数の検体のデータから、検体間で共通して現れる変動のパターン（主成分）を見つけ出し、上位のいくつかを取り除く方法があります。主成分分析は、たくさんの数字の組み合わせの中から、ばらつきを最もよく説明する「軸」を順に取り出す統計の手法です。NIPTのデータでは、上位の主成分の多くが、染色体の数とは関係のない実験上の変動を表しています。2015年の研究は、主成分を取り除く正規化を用いて、染色体の一部の欠失や重複（部分的な異常）の検出を報告しています[12]。

別の考え方として、調べたい領域と同じような振る舞いをする「参照ビン」を同じ検体の中から選び、その検体の中だけで比べる方法もあります。2014年に報告されたWISECONDORはこの考え方を用いており[13]、2019年には改良版のWisecondorXが、低い深度の全ゲノムシークエンスでのコピー数の検出法として報告されました[14]。2017年の研究でも、検体内の比較と検体間の比較を組み合わせる新しいアルゴリズムで感度が向上したと報告されています[15]。

ただし、基準となる集団の中にトリソミーの検体が混ざっていると、基準そのものがずれてしまいます。21番染色体はもともとトリソミーが起こりやすい染色体なので、基準集団から異数性の検体を除くこと、少なくとも平均ではなく中央値のような外れ値に強い方法で基準を計算することが重要です。

5. 外れ値に強い平均：中央値と四分位範囲

ここまでの補正をすり抜けた外れ値のビンがあっても結果が揺らがないように、染色体の代表値を中央値で、ばらつきを四分位範囲（IQR）などで評価する頑健な方法が役立つ場合があります。ただし、適切な集計方法は検出対象と解析法によって異なり、中央値は小さな局所CNVの信号を弱めることもあります。外れ値には、母親自身のコピー数の変化（CNV）のような生物学的な原因と、アライメントの誤りのような解析上の原因の両方があります。

平均値は外れ値1つで動く

平均値は全部の値を足して数で割るため、極端な値が1つあるだけで大きく動きますが、中央値は値を順に並べた真ん中なので、ほとんど動きません。簡単な例で確かめます。10個のビンのうち9個が100本、1個だけが150本だったとします。平均値は（100×9＋150）÷10＝105本で、5%も上がって見えます。一方、中央値は100本のままです。

母親のCNVで考える計算例

母親自身が、ある染色体の一部にコピー数の増加（CNV）を持っていると、その部分のビンはおおむね50%近く多く読まれ、平均値で計算すると、トリソミーと区別がつかなくなることがあります。母親のCNVは母親の血液細胞由来のDNA全体に含まれるため、そのビンでは2コピーが3コピーになり、胎盤由来DNAの割合をf、胎盤に重複がないとすると、混合血漿中での局所的な増加は0.5×（1−f）です。f＝4%なら約48%の増加になります。

ある染色体のビンのうち割合pの部分に、母親の重複（＋50%）があるとします。胎盤に重複がない場合、平均値は「0.5×（1−f）×p」だけ上がります。fは胎児ゲノム率です。一方、胎児ゲノム率4%の胎児のトリソミーは、平均ビン値を約2%上げます。すると、0.5×0.96×p＝2%となるp≒4.17%、つまり染色体の約4.2%を占める母親の重複だけで、平均値の上ではトリソミーと同じだけの上昇が起こります。中央値の場合、外れ値のビンが少数であれば平均値より影響が小さいため、このような小さな重複には引きずられません。

図2　母親の重複と胎児のトリソミーの見え方の違い（計算例による模式図）。胎児のトリソミーは染色体のすべてのビンを少しずつ押し上げますが、母親の重複は一部のビンだけを大きく押し上げます。

これは理論上の話ではありません。2015年の研究は、WGS法のNIPTで陽性と判定されたのに胎児が正常だった例の一部が、母親自身のCNVによって説明できることを示しました[16]。初期のアルゴリズムの中には、母親のCNVを見つけて除く処理がなく、平均値を使っていたために、CNVを持つ染色体の平均ビン値が押し上げられて偽陽性になった例があったと考えられています。母親のCNVを見つけて除くしくみは母親のコピーナンバーバリアントのページで、偽陽性の原因としての母体側の要因はNIPTの偽陽性の原因：母体側の要因のページで解説しています。

ばらつきの物差しも頑健にする：IQRとMAD

平均だけでなく、ばらつきの大きさを測る物差しにも外れ値に強いものを使うことが大切です。標準偏差は、平均からの差を2乗して足し合わせるため、外れ値の影響を特に強く受けます。外れ値のビンが混ざると標準偏差が膨らみ、本物のトリソミーの信号まで「誤差のうち」に見えてしまうおそれがあります。

統計学では、どれだけの割合の値がおかしくなっても推定が壊れないかを「崩壊点」という指標で表します。平均値と標準偏差の崩壊点は0%で、極端な値が1つあるだけで、いくらでも大きく動きえます。中央値の崩壊点は50%、四分位範囲は25%です。中央値からの差の絶対値の中央値をとる中央値絶対偏差（MAD）は、崩壊点が50%で、外れ値に最も強いばらつきの物差しの一つです[17]。外れ値を見つけるときに、平均と標準偏差ではなく中央値とMADを使うべきだという考え方は、統計の分野で広く勧められています[18]。NIPTでも、ばらつきの評価に四分位範囲やMADのような頑健な物差しを使う方法があります。ビン間のばらつきと正常な参照検体間のばらつきは異なり、Zスコアの分母は解析法に合わせて推定・検証する必要があります。

6. 4つの処理のあとに残るもの：観測リード密度

リードをビンに配置し、GCバイアスとマッパビリティを補正し、系統的な偏りを正規化し、外れ値に強い方法で平均をとると、調べたい染色体の「観測されたリード密度（μobs）」が得られます。この値が、このページで説明してきた平均ビン値の最終的な形です。

ただし、μobsだけでは、その染色体が多いか少ないかは判断できません。判断するためには、さらに2つの情報が必要です。1つは、その染色体が2本だった場合に期待される密度（μexp）で、これはリード密度の期待値のページで扱います。もう1つは、正常な検体でμobsとμexpが平均的にどのくらいずれるかという大きさです。この3つがそろうと、Zスコア＝（μobs−μexp）÷（ずれの大きさ）が計算できます。

補正しても残る限界

ここで説明した補正は、測定の誤差を小さくするためのものであり、生物学的な理由で胎児の信号そのものが小さい場合や、胎児以外の信号が混ざる場合までを解決するものではありません。たとえば、胎児由来のDNAの割合（胎児ゲノム率）が低いと、トリソミーの信号そのものが小さくなり、どれだけ誤差を減らしても区別が難しくなります。胎盤だけに染色体の変化がある場合や、母親自身に染色体の変化がある場合には、測定が正確であるほど、その変化が正しく結果に表れます。

つまり、補正によって精度が上がっても、NIPTが胎盤由来のDNAを母親のDNAと混ぜた状態で数える検査であるという性質は変わりません。NIPTが確定検査ではなく、陽性のときには羊水検査などで確かめる必要がある理由は、こうした生物学的な限界にあります。

よくある質問（FAQ）

まとめ

WGS法のNIPTは、ゲノムをビンに分けてリード数を数え、染色体ごとの平均ビン値を比べる検査です。独立で同じ分散を持つビンの算術平均では、誤差は標準誤差σ/√Nで決まり、Nは染色体とビンの大きさで決まるため、精度を上げる鍵はビンごとのばらつきσを小さくすることにあります。σには、ポアソン分布で決まる下限σ≒√（1ビンあたりのリード数）があり、偏りがなければ、ある程度の胎児ゲノム率のトリソミーは数え上げの統計だけで見分けられます[1]。

実際のデータでは、GC含量による読まれやすさの偏り（GCバイアス）、同じ配列の繰り返しによる配置の偏り（マッパビリティ）、原因不明でも再現する系統的な偏り、そして母親のCNVのような外れ値が、σを下限より大きくします。WGS法のNIPTは、読み取り効率の逆数による補正、配置可能な割合による割り戻し、多数の検体を使った正規化、中央値と四分位範囲による頑健な計算によって、これらの影響を減らします。ただし、処理の種類・順番・代表値の計算方法は解析法によって異なります。こうして得られた観測リード密度が、期待値との比較とZスコアの計算へと進みます。

NIPTの教科書：第3章のページ

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