acmgガイドライン｜バリアントの分類方法・表記方法について1

2015年5月発表の米国分子病理学会と米国ゲノム・遺伝医学学会のガイドライン
こちらの論文を翻訳したいと思います。

＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
Genet Med. 2015 May ; 17(5): 405–424. doi:10.1038/gim.2015.30.

配列変異体の解釈のための標準およびガイドライン:
米国遺伝医学ゲノム学会および分子病理学会の共同コンセンサス勧告免責事項:
本ACMG規格およびガイドラインは、臨床検査の遺伝学者が質の高い臨床検査サービスを提供するのを助けるために、主に臨床検査の遺伝学者向けの教育資源として作成された。
これらの基準およびガイドラインの遵守は任意であり、必ずしも医学的転帰の成功を保証するものではない。
またここには、合理的に考えて同じ結果が得られるよう指向した好ましい手順および検査法が網羅されているわけでも、そうでない手順および検査法が除外されているわけでもないと考えてほしい。
臨床検査室の遺伝学者は，特定の手順または検査法の妥当性を決定する際に、個々の患者または検体が提示する特定の状況に自身の専門家の判断を適用すべきである。
臨床検査室の遺伝学者は、特定の手順または検査の使用の理論的根拠を、それが本基準およびガイドラインに適合しているかどうかにかかわらず、患者の記録に記録することが推奨される。
また、特定のガイドラインが採択された日に注意を払い、その日以降に利用可能となる他の関連する医学的および科学的情報を検討するよう勧告される。
また、知的財産権の利害が、特定の試験やその他の試験の実施を制限するかどうかを考慮することも賢明であろう。

本基準および本ガイドラインは、2014年12月15日にACMG理事会により、2015年1月9日にAMP理事会により承認された。

抄録

American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)は、以前配列変異の解釈のためのガイダンスを開発した。 1

過去10年間、ハイスループットな次世代シークエンシングの出現により、シークエンシング技術は急速に進化してきた。
次世代シークエンシングの採用と活用により、臨床検査室は現在、遺伝子型タイピング，単一遺伝子，遺伝子パネル，エキソム，ゲノム，トランスクリプトーム、および遺伝性疾患のエピジェネティックアッセイに及ぶ遺伝子検査のますます増加するカタログを実施している。
遺伝子検査におけるこのパラダイムシフトは、複雑さの増大により、配列解釈における新たな課題を伴っている。
この文脈において、ACMGは2013年に、ACMG，Association for Molecular Pathology (AMP) および the College of American Pathologists (CAP)の代表者で構成されるワークグループを招集し、配列変異の解釈のための標準およびガイドラインを再検討し改訂した。
このグループは臨床検査責任者および臨床医で構成された。
本報告書は、ACMG，AMP，CAPのステークホルダーからのインプットをもとに、ワークグループの専門家の意見を表している。
これらの勧告は主に、遺伝子型タイピング，単一遺伝子，パネル，エキソーム，ゲノムなどの臨床検査室で使用される遺伝子検査の幅に適用される。

この報告では、メンデル系疾患で同定された変異体を記述するために、特定の標準用語「病原性」，「病原性の可能性が高い」、「意義不明」、「良性の可能性が高い」、「良性」の使用を推奨している。
さらに本勧告では、典型的な種類の変異証拠(例えば、集団データ・計算データ・機能データ・分離データなど)を用いて、
基準に基づいて変異をこれら5つのカテゴリーに分類するプロセスについて記述する。

CLIA承認の臨床検査室で実施され、
その結果は委員会の認定を受けた臨床分子遺伝学者または分子遺伝病理学者または同等物によって解釈される。

はじめに

臨床分子研究室では，遺伝性疾患に関連する遺伝子の数が急速に増加している患者検体を検査する過程で、新規の配列変異体を検出しつつある。
ある表現型は単一の遺伝子と関連しているが、多くの表現型は複数の遺伝子と関連している。
特定の配列変異体の臨床的意義についてのわれわれの理解は、その変異体が疾患に対してほぼ確実に病原性を示すものから、ほぼ確実に良性であるものまで、勾配に沿っている。
以前のACMGの勧告では、配列変異の解釈カテゴリーおよび解釈のためのアルゴリズムが提供されていたが、これらの勧告は定義された用語または詳細な変異分類の手引きを提供していなかった。 1
本報告では、専門家の意見および経験的データによって知らされた基準を用いて、配列変異体の分類に関する最新の標準およびガイドラインについて述べる。

方法

2013年には、臨床検査責任者および臨床医を代表するACMG，AMP，およびCAPメンバーで構成されるワークグループが設立され、専門家の意見、ワークグループのコンセンサスおよび地域社会からのインプットを通じて開発されたシステムに従って重み付けされた入手可能な証拠を用いて、配列変異を分類するための標準用語の使用に関する勧告を開発することを目的とした。

臨床検査室コミュニティの見解を評価するために、GeneTests.orgに記載されている米国(米国)およびカナダの100以上の配列決定検査室に調査を送付し、用語の選択および変異型を分類するための証拠の評価に関する入力を要請した。
臨床検査の経験には、まれな疾患のほか、ゲノム薬理学および体細胞がんの検査が含まれていた。
用語の選択を評価することを目的とした最初の調査は2013年2月に送られ、その結果は2013年ACMG年次総会で75名以上の参加者を含む公開フォーラムで発表された。調査回答者は北米の45以上の研究所を代表している。

調査とオープンフォーラムの結果から、(1) pathogenic, likely pathogenic, uncertain significance, likely benign, and benign という用語を用いた5段階の用語体系が好まれ、すでに大多数の研究所で使用されており、(2)作業グループの最初の労力はメンデル型とミトコンドリア型の変異体に焦点を当てるべきであることが示された。

最初の調査では、検査室にも変異型評価のプロトコルの提供を依頼し、11件の方法を共有した。
提出された全てのプロトコルを分析することによって、ワークグループは、バリアント証拠を重み付けするための基準セットと、
5つの分類階層のうちの1つに到達するための基準を組み合わせるための規則セットを開発した。
作業部会のメンバーは、すでに分類されている変異体を用いて数週間、研究室内でこのスキームを試験した。

彼らの研究室および、またはより広範なコミュニティーによる。
さらに最も一般的な種類の証拠を有する変異株の典型例について、分類の割り当てについて検証し、作業部会メンバーが一貫して適用する現在のアプローチに従って、システムがこれらの変異株を分類することを確実にした。
2回目の調査は、GeneTests.org およびAMPのリスト・サーブを通じて2013年8月に約2000名のメンバーから同定された同じ研究所に送付され、提案された分類スキームと各基準の使用方法を記述した詳細な補遺が記載された。
試験所には、このスキームを用い各基準の適合性および相対的重み付け、分類システムの使用の容易さ、および自らの試験所でこのようなシステムを採用するかどうかについてのフィードバックを提供するよう依頼した。
33を超える研究所からの回答は、提案されたアプローチに対する大多数の支持を示し、フィードバックは提案された基準およびガイドラインの開発をさらに導いた。

また，乳がん，結腸がん，囊胞性線維症の健康診断を受けた遺伝子に関する変異型分類ガイドラインを開発した。
他の専門家学会およびワーキンググループからの推奨事項に関する文献の評価、および特定の疾患における変異型の定量的評価のための統計解析プログラム 2-5。
これらの変異型解析ガイドラインは特定の設定では有用であるが、提案された基準を全ての遺伝子および異なる実験室設定に適用することは困難であった。
本稿で述べる変異型分類アプローチは、単一遺伝子検査，複数遺伝子パネル、エクソーム配列決定またはゲノム配列決定によって同定されるかどうかにかかわらず、全てのメンデル遺伝子の変異体に適用可能であることを意図している。
我々は、技術と知識が向上するにつれて、この変異型分類アプローチが進化することを期待する。
また、特定の疾患グループで働く人々は、特定の遺伝子における変異の分類に関して、特定の基準に割り当てられる適用可能性および重みが遺伝子および疾患によって異なる可能性があることを考慮して、より焦点を絞ったガイダンスを作成し続けるべきであることにも留意すべきである。

一般的考察

用語

突然変異はヌクレオチド配列の恒久的変化と定義され、多型は1%を超える頻度をもつ変異体と定義される。
しかし、広く使われている「突然変異」や「多型」という言葉は、しばしばそれぞれ病原性および良性作用の誤った仮定により混乱を招く。

したがって，両用語を「バリアント」という用語に置き換えて、
(1)病原性、(2)病原性の可能性が高い、(3)意義不明、(4)良性の可能性が高い、または(5)良性
の修飾語とすることが推奨される。
これらの修飾因子はすべてのヒトの表現型を扱うわけではないが、本ガイダンスで扱うメンデル病に関連する変異体の分類の5段階のシステムを構成する。
病原性(「可能性のある病原性」を含む)のすべての主張は、状態および遺伝パターン(例えばc)に関して報告することが推奨される。

1521_1523delCTT (p.Phe508del), pathogenic, cystic fibrosis, autosomal recessive).

いくつかの研究所が追加の階層(例えば特に機関内で、意味不明の変異(VUS)の亜分類)を選択することがあり、この実践がこれらの推奨事項と矛盾するとは考えられないことに留意すべきである。

またここで推奨する用語は、細胞遺伝学的マイクロアレイにより検出されるコピー数変異体(CNV)を分類するための現在の推奨とは幾分異なることにも留意すべきである。
6CNVに推奨されているスキーマは5段階とも、「臨床的意義不明-病原性の可能性が高い」および「臨床的意義不明-良性の可能性が高い」を使用している。

変異体を「可能性の高い」カテゴリーに分類するための本稿で提示した基準は、CNVガイドラインで概説したよりも強力な証拠を含んでおり、これら2つのカテゴリーを組み合わせることで、医療提供者および臨床報告を受けている個人に混乱を生じさせると思われたため、ワークグループの大多数は「病原性の可能性が高い」または「良性の可能性が高い」という用語を修正するために「uncertain significance」を用いることを支持していなかった。
しかしながら、用語「可能性が高い」の使用はデータが病原性である可能性が高いか、またはそれが良性である可能性が高いことを支持する変異体に限定されるべきであると考えられた。
「可能性が高い」という用語の定量的定義はないが、ある種の変異型分類の設定ではガイダンスが提唱されている。
しかし、ACMGオープンフォーラムでのコミュニティの調査では「可能性あり」という用語の使用範囲がはるかに広いことが示唆された。
これを認識し、我々は「病原性の可能性が高い」および「良性の可能性が高い」という用語は、実験室に共通の、しかし恣意的な定義を提供するために、疾患を引き起こす変異体または良性の変異体の90%を超える確実性を意味するように使用されることを提案する。

同様に、International Agency for Research on Cancer (IARC)ガイドライン2は、95%レベルの病原性の確実性を支持しているが、ワークグループ(ACMGオープンフォーラムのフィードバックにより確認)は、臨床医および患者は90%の決定につながるわずかに高い誤りの可能性に耐えようとしていると感じていた。

現在のところ，ほとんどの変異体は、ほとんどの疾患の異質性を考慮して、5つのカテゴリーのいずれにも変異体の確実性を定量的に割り当てることを支持するデータを持っていないことにも留意すべきである。
病原性の信頼度を変異体に客観的に割り当てるために、経時的に実験的および統計的アプローチが開発され、信頼度に関して臨床コミュニティが何を望んでいるかを定義するためのより厳密なアプローチが、用語および可能性をより完全に知らせることが期待される。

新しい用語の使用には，地域社会の教育が必要であろう。専門学会は、これらの用語の使用について全ての検査室および医療提供者を教育することを奨励され、検査室は、オーダーする医師を直接教育することも奨励される。

命名法

バリアントの明確な指定を確実にし、ゲノム情報の効果的な共有と下流での利用を可能にするために、標準化された基準のセットによって知らされた統一された命名法が推奨される。
標準的な遺伝子変異命名法(http:// www.hgvs.org/mutnomen)は、ヒトゲノム変異学会(HGVS)7によって維持され、バージョン化されており、その使用は記載がない限り変異命名法を決定するための主要ガイドラインとして推奨される。　6
試験所は、試験方法に使用されているバージョンに注目すべきである。

変異体を記述するための正しいHGVS命名法(https://mutalyzer.nl)を提供するツールが利用可能である。 8
臨床報告書には、DNAレベルでの変異体の明確な命名を確実にするための配列参照、ならびに機能的解釈を補助するためのコードおよびタンパク命名法、(例えば，ゲノム配列については「c.」、タンパクをコードするDNA配列については「p.」、ミトコンドリアについては「m.」など)を含めるべきである。

コード命名法は、ATG翻訳開始コドンの「A」を位置番号1として記載すべきである。
歴史的代替命名法が用いられている場合、現在の命名法は歴史的命名法の追加の表記法とともに用いるべきである。

参照配列は，完全であり、
版数をもつ　NCBI RefSeqデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)　9
またはLocus Reference Genomic (LRG)データベース(http://www.lrg-sequence.org)のいずれかに由来する。　10
ゲノム座標を用い、標準的なゲノム構築(例えば，hg19)に従って定義する、
または遺伝子全体をカバーするゲノム参照配列(5′および3′非翻訳領域(UTR)およびプロモーターを含む)を用いる。

コード変異体を記述する際には、各遺伝子の参照転写物を用い、報告書に提示すること。

転写産物は、最も長い既知の転写産物および、または最も臨床的に重要な転写産物を表すべきである。
コミュニティ支援の参考転写物は、しばしば LRG10，CCDSデータベース11、ヒト遺伝子変異データベース(http://www.hgmd.cf.ac.uk)、ClinVar(www.ncbi.nlm.nih.gov/ clinvar)または遺伝子座特異的データベースを通じて同定できる。

しかしながら、臨床的に解釈可能な既知の変異体が存在する場合、研究室は、追加のエキソンを含む代替転写物または伸長した非翻訳領域を含む全ての臨床的に関連性のある転写物に対する変異体の影響を評価すべきである。

すべての種類の変異体(例えば複雑な変異体)がHGVSの勧告の対象となるわけではないが、複雑な変異体についての記述の可能性は報告されている。　7,12

さらにこのACMG勧告は、HGVS の命名法規則に対する3つの特別な例外を支持している:
1)「*」および「Ter」の現在のHGVS勧告に加えて「X」はナンセンス変異体の報告における使用に依然として許容できると考えられている;
2)エキソンは、変異体を指定するために使用される選択した参照転写物に従って番号を付けることが推奨されている;
そして
3)臨床的解釈が病原性を直接評価するのが典型的であるため「機能に影響する」という用語の代わりに「病原性」という用語が推奨されている。

文献とデータベースの利用

多くのデータベースは，ヒトゲノムで発見され続けている多くの変異体を含んでいる。
変異型を分類し報告する場合、臨床検査室はデータベースおよび発表された文献に貴重な情報を見出すことがある。
上述のように、配列データベースを用いて適切な参照を同定することもできる。

配列データベースは情報収集に有用であるが、注意して使用すべきである。

集団データベース(表1)は、大規模集団における変異の頻度を得るのに有用である。
個体群データベースは健常個体のみを含むと仮定することはできず、病原性変異体を含むことが知られている。
これらの集団データベースには、これらの変異体の機能的影響、または関連した表現型に関する広範な情報は含まれていない。
集団データベースを使用する場合、健常コホートまたは疾患コホートを使用したかどうか、可能であれば、家族に複数の個人が含まれていたかどうか、および被験者の年齢範囲を決定しなければならない。

疾患データベース(表1)は主に、疾患を有する患者にみられる変異株および変異株の病原性の評価を含んでいる。
疾患および遺伝子特異的データベースは、多くのデータベースがエビデンスの一次レビューを実施していないため、ピアレビューされた文献で発表された不正確な主張を含めて、しばしば誤って分類された変異体を含む。
疾患データベースを用いる場合、以下に述べるように患者がどのように確認されたかを考慮することが重要である。

データベースを使用する場合、臨床検査室は、
(1)データベースが更新される頻度、データ硬化が支持されるかどうか、およびどの方法が硬化に使用されたかを決定すること。
(2)HGVS命名法の使用を確認し、変異体の命名に使用されるゲノム構築および転写物参考文献を決定すること。
(3)データの分析精度が検証される程度を決定すること(例えば次世代ローパスシークエンシングvs Sangervalidated variants)、
およびデータの精度を評価するために提供される品質測定基準を評価すること(関連する出版物を読む必要がある場合がある)、ならびに
(4)列挙された観察の出典および独立性を決定すること。

多様な評価には、科学文献および医学文献の検索も含まれる。
古い命名法および分類法を用いた文献，または単一の観察に基づく文献は慎重に使用すべきである。
変異型を有する個人および家族を同定する際には、関連する表現型とともに、患者がどのように確認されたかを考慮することが重要である。
この注意は、罹患者および関連患者が試験の状況および規模に応じて複数回報告されることが多いため、出版物からのデータを評価する際に重要である。
これは著者の重複、研究室間の協力、発端者および家族が異なる臨床システムにわたって追跡されていることによるものと考えられる。
これは誤って罹患患者の重複計数および変異体頻度の誤った増加につながる可能性がある。

重複する著者または施設は、重複するデータセットの可能性に対する最初の手がかりである。

臨床検査室は、報告時に各遺伝子および臨床的主張において同定された全ての配列変異体を追跡するための内部システムを実施すべきである。
これは遺伝子型-表現型の相関、および罹患集団と正常集団における変異の頻度を追跡するために重要である。
臨床検査室は、変異型分類に用いられる臨床的アサーションおよび証拠を含め、ClinVarなどの変異型データベースに貢献し、ヒトの変異の影響の継続的な理解を助けることが推奨される。
可能な限り、医療保険の持ち運び可能性に従って、臨床情報を提供すべきである。

プライバシーに関する説明責任法(HIPAA)の規制臨床検査室は、遺伝子型が臨床表現型にどのように影響するかをよりよく理解し、検査室間の変異型解釈の差異を解決するための臨床情報を提供するために、臨床医との協力を築くことが推奨される。
臨床検査の実施を支援する大きな可能性のために、臨床変異データベースの拡大と標準化のための努力が進行中である。

標準化は、臨床検査室からの提出を促進するだけでなく、最新の情報へのアクセスも容易にする。
例えば、ClinVar データベースでは、臨床所見および主張を伴う変異株の蓄積が可能であり、治癒の質のレベルをより透明に見ることができるように審査状況が追跡される。

計算(インシリコ)予測プログラム

公的にも市販でも入手可能な様々なインシリコツールが、配列変異体の解釈に役立つ。
各ツールによって使用されるアルゴリズムは異なってもよいが、一次および代替遺伝子転写物、他のゲノム要素に対する変異体の影響の決定、ならびにタンパクに対する変異体の潜在的影響の決定を含む、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでの配列変異体の影響の決定を含み得る。

そのようなツールの2つの主要なカテゴリーには、ミスセンス変化が結果として生じるタンパクの機能または構造に損傷を与えるかどうかを予測するもの、およびスプライシングに影響があるかどうかを予測するものがある(表2)。より新しいツールはさらなる非コード配列に対処し始めている。　13

ミスセンス変化の影響は、アミノ酸またはヌクレオチドの進化的保存、タンパク配列内の位置および状況、およびアミノ酸置換の生化学的結果などの基準に依存する。これらの基準の1つまたは組み合わせの測定は、ミスセンス変化の予測される影響を評価する様々なインシリコアルゴリズムで使用される。利用可能な予測ソフトウェアの性能を評価し、それらを互いに比較しそれらの予測能力を評価するいくつかの努力がなされている。

「既知の」疾患を引き起こす変異型14-17

一般にミスセンス変異予測のためのほとんどのアルゴリズムは、既知の疾患変異を調べる場合、65～80%の正確さである。　16
ほとんどのツールは，特異性が低く，ミスセンス変化を有害なほど過剰予測する傾向があり、ミスセンス変異体を予測するのにあまり信頼できず、より軽度の影響がある。　18
臨床検査室でミスセンス変異体の解釈に一般的に使用されるインシリコツールには、PolyPhen219，SIFT20、および　MutationTaster21　が含まれる。

ミスセンス変異予測インシリコツールの一覧を表2に示す。

スプライシングは、エキソンレベルまたはイントロンレベルでのスプライシング部位の生成または喪失に関連するので、スプライシングを予測するために複数のソフトウェアプログラムが開発されている。　22
一般にスプライス部位予測ツールは、スプライス部位異常の予測において特異性(～60～80%)に比べて感度が高い(～90～100%)。　23,24
スプライス部位変異体の解釈によく用いられるin-silicoツールの一覧を表2に示す。
異なるソフトウェアプログラムの多くは、予測のために異なるアルゴリズムを使用するが、それらは基礎的な基礎において類似性を有する;従って、異なるインシリコツールからの予測の組み合わせは、独立した証拠部分とは対照的に，配列解釈における単一の証拠部分として考慮される。配列変異の解釈に複数のソフトウェアプログラムを用いることも推奨される。なぜなら、次のような違いがあるからである。
プログラムはそれぞれアルゴリズムに依存して独自の強みと弱みを持ち、多くの場合、遺伝子やタンパクの配列によって性能が異なる。
しかしながらこれらは予測に過ぎず、配列変異の解釈におけるそれらの使用は注意深く使用されるべきである。これらの予測を唯一の証拠源として臨床的主張に用いることは推奨されない。

配列変異体の解釈のための提案された基準

ある変異株のエビデンスを評価するための以下のアプローチは、臨床診断検査施設で遺伝性(主にメンデル)疾患が疑われる患者に認められる変異株の解釈を目的としている。
これは、体細胞変異、薬理ゲノム学的変異、または多遺伝子性非メンデル型複合疾患に関連する遺伝子の変異の解釈を意図したものではない。エキソームまたはゲノム研究(下記の特別な考察の節を参照)の文脈において、これらの規則を候補遺伝子(「意味不明の遺伝子」、GUS)に適用する場合、このガイダンスは、疾患における新しい遺伝子を同定するための研究コミュニティのニーズを満たすことを意図していないため、注意を払わなければならない。

これらのアプローチは、
健康な個人にみられる変異，または検査の適応症に続発する変異の評価に用いることができるが、
適応症とは無関係な変異のほとんどが病原性である可能性が低いことを考慮すると、ガイドラインのいくつかの部分で指摘されているように、さらなる注意を払う必要がある。

単一の遺伝子、遺伝子パネル、エキソーム、ゲノムまたはトランスクリプトームの分析によって、変異体が同定されたかどうかにかかわらず、一般的にこれらのガイドラインは変異体の分類に適用されると予想されるが、変異体を疾患の病原性(すなわち，原因)と関係づけることと、変異体がコードするタンパクに対して破壊的/損傷的であると予測されうるが、必ずしも疾患に関係づけられるわけではない変異体との間の差異を考慮することが重要である。

これらの法則は、メンデル系疾患において決定的な役割を果たす遺伝子の変異体が、その疾患に対して病原性をもつかどうかを決定することを意図している。
病原性の決定は、特定の患者における疾患の原因の解釈とは無関係であるべきである。
例えば、ある変異体がある症例では病原性と報告されてはならず、別の症例では病原性と報告されてはならない。
その理由は、その変異体がある症例では病気を説明するとは考えられないからである。
病原性は研究された全ての症例を含む総計の証拠の全体によって決定されるべきであり、単一の結論に至るべきである。

この分類アプローチは、今日まで研究所が適用してきたものよりもいくぶん厳しい可能性がある。
おそらくそれらは、不確実な有意性として分類される変異体の割合を高めることになる。
このアプローチは、疾患の「原因」として報告されている変異体の実質的な数を、その分類を裏付ける十分な証拠がなくても減少させることが期待される。
臨床検査室が異型を病原性と報告する場合、医療提供者は「実行可能」とみなし、その決定に基づいて患者25の治療またはサーベイランスを変更するか、または遺伝子型陰性家系員におけるそのような経営者を取り除く可能性が高いことを心に留めておくことが重要である(後述の「医療提供者はこのガイドラインをどのように使用すべきか」の考察を参照のこと)。

我々は2組の基準を提供した:1つは病原性または病原性の可能性のある変異体の分類(表3)、もう1つは良性または良性の可能性のある変異体の分類(表4)。各病原性基準は非常に強い(PVS1)、強い(PS1-4)と重み付けされる;

中等度(PM1-6)または支持性(PP1-5)および各良性基準は、独立型(BA1)，強力(BS1-4)または支持性(BP1-6)として重み付けされる。
各カテゴリー内の番号は，体重の違いを示さず、単に異なる基準を参照するのに役立つように表示されている。

所与の変異体について、利用者はその変異体について観察された証拠に基づいて基準を選択する。

次に、表5のスコアリングルールに従って基準を組み合わせ、5階層システムから分類を選択する。

この規則は、現在調査中の症例について集められたものであろうと、以前に発表されたデータを十分に検証したものであろうと、バリアントに関する入手可能なすべてのデータに適用される。
未発表の症例データは、公共資源(例えば ClinVar または遺伝子座特異的データベース)および研究所独自のデータベースから入手することもできる。

バリアント分類に決定的な柔軟性を提供するために、収集されたエビデンスに応じて専門家の判断により、一つの重みとして挙げられたいくつかの基準を別の重みに移すことができる。

例えば他の病原性変異体とのトランス(反対の染色体上)における変異体の検出に関して複数の観察が認められた場合には、ルールPM3を強力にアップグレードすることができる(さらなるガイダンスについてはセクションPM3を参照)。

対照的にデータが記載したほど強くない状況では、エビデンスがより低いレベルを満たしていると判断することができる(例えば表3のPS4，注2を参照)。

変異体がこれらの設定(病原性または良性)のいずれかを用いて基準を満たさないか、または良性と病原性の証拠が矛盾する場合、その変異体はデフォルトで Uncerd Significance となる。
補足資料には、種類と力価によって判定基準をまとめた図が追加されている(図1参照)。

バリアント証拠の強さの違いを説明するために、証拠の全体を評価する際には、専門家の判断を適用しなければならないことに留意されたい。

以下に、変異型分類の基準(表3および表4)に記載されている特定の概念をより詳細に説明し、その使用における例および/または注意点または落とし穴を示す。このセクションは表3および表4と一緒に読むべきである。

PVS1ヌル変異体

ある種の変異体(例えば，ナンセンス，フレームシフト、標準的な±1または2スプライス部位，開始コドン，単一エキソンまたは複数エキソン欠失)は、転写の欠如または変化した転写産物のナンセンス媒介性崩壊によって遺伝子産物の完全な欠如を導くことによって、遺伝子機能を破壊するとしばしば仮定することができる。

しかしながら、以下の原則を考慮することによって、これらの変異体を病原性として分類する際に注意を払わなければならない。

このような変異体を病原性として分類する場合、ヌル変異体がその疾患について確立された遺伝パターンと一致する既知の病原性機序であることを保証しなければならない。例えば、ヘテロ接合のミスセンス変異体のみが疾患を引き起こし、欠失変異体がヘテロ接合の状態で良性である遺伝子がある(例えば，多くの肥大型心筋症遺伝子)。
MYH7遺伝子における新規のヘテロ接合性ナンセンス変異体は、この証拠のみに基づいて優性肥大型心筋症に対して病原性を示さないと考えられるが、CFTR遺伝子における新規のヘテロ接合性ナンセンス変異体は、劣性病原性変異体と考えられるようである。
文献で病原性であると確立されているほとんどの3’切断変異体の下流で切断変異体を解釈する場合にも注意が必要である。
このことは、変異体が最後のエキソンまたは最後の50 bpsに存在する場合に特に当てはまる。
ナンセンスが介在する崩壊26が予測されないような最後から2番目のエキソン、および発現されるタンパクのより高い可能性が存在する。
しかし、予測される切断型タンパクの長さも病原性の帰属に組み込まれ，このような変異体は機能的アッセイなしでは解釈できない。
スプライス部位の変異体については、別のドナー/アクセプター部位の使用または新しい部位の作製のために、この変異体はエキソンスキッピング，イントロン物質の短縮または封入をもたらし得る。
スプライス部位の変異はヌル効果をもたらすと予測されるが、影響の確認にはRNAまたはタンパク分析のいずれかによる機能分析が必要である。
またインフレーム欠失/挿入の可能性を考慮しなければならず、これはタンパクの重要なドメインを保持し、それゆえ、わずかな長さ変化(PM4)を伴う軽度または中性の効果、または機能獲得効果のいずれかをもたらす。
交互の遺伝子転写産物の存在を考慮し、どの遺伝子転写産物が生物学的に関連性があるのか、またどの組織で産物が発現しているのかを理解することが重要である。切断型変異体が1つだけに限られるか、またはすべての転写産物に限られない場合、他のタンパクアイソフォームの存在を考えると、変異体の過剰な解釈の影響について慎重でなければならない。
また、エキソンが選択的スプライシングを受ける可能性を考えると、他の病原性変異体が記載されていないエキソンにヌル変異体が発見されれば疾患に至ると仮定する際にも注意が必要である。このことは、その状況で病原性変異株が発見される可能性が低いことを考慮すると、予測された切断変異株が偶発的所見(検査の適応とは無関係)として同定された場合に特に当てはまる。

PS2 PM6 De novo variants

de novoで生じた変異株(親検体検査陰性)は、以下の条件を満たす場合，病原性を強く裏付けるものと考えられる。

両親サンプルとも同一性試験により、患者の生体親であることが示された。
注:同一性が想定されているが確認されていない場合はPM6を適用する。
患者は de novo遺伝と一致する疾患の家族歴を有する(例えば優性疾患に対する罹患していない両親)。
しかし生殖細胞系モザイク現象により、複数の兄弟姉妹が影響を受ける可能性がある。
患者の表現型は，遺伝子の疾患関連性と合理的な特異性と一致する。
例えば，この議論は，NIPBL遺伝子にde novo変異を有し，特徴的な顔面特徴、多毛症および上肢欠損(すなわち，Cornelia de Lange症候群)を有する患者にとっては強いが、発達遅滞などの非特異的な特徴を有する小児におけるエキソーム配列決定で認められる de novo変異では弱いと考えられる。

PS3 BS3の機能研究

機能的研究は病原性を裏付ける強力なツールとなりうるが、すべての機能的研究が遺伝子やタンパクの機能への影響を予測するのに有効というわけではない。
例えば特定の酵素アッセイは、代謝経路における酵素機能(例えば，α-ガラクトシダーゼ酵素機能)に対するミスセンス変異体の影響を評価するための十分に確立されたアプローチを提供する。
他方、いくつかの機能的アッセイは、タンパク機能に対する変異体の影響の予測因子として一貫性が低いかもしれない。機能的アッセイの妥当性を評価するために、機能的アッセイが生物学的環境をどの程度反映しているかを考慮しなければならない。例えば患者または動物モデルからの生検組織から直接酵素機能をアッセイすることは、インビトロでタンパクを発現するよりも強力な証拠を提供する。同様にアッセイがタンパクの完全な生物学的機能(例えば酵素による基質分解)を反映する場合、機能の1つの成分(例えばさらなる結合特性を有するタンパクに対するATP加水分解)と比較して、証拠はより強力である．検定法の分析性能を評価し、検体の完全性を説明するバリデーション、再現性および頑健性データは、収集の方法および時間、ならびに保管および輸送によって影響を受けることがあり、考慮すべき重要な因子である。
これらの因子は、CLIAの研究室で開発された試験または市販のキットでのアッセイの場合に軽減される．変異体の影響をmRNAレベルで評価するアッセイは、スプライス接合部およびコード配列内、非翻訳領域内、ならびにより深いイントロン領域(例えばmRNAの安定性、プロセシング、または翻訳)内での変異体の効果を評価する場合に、非常に有益な情報となり得る。技術的アプローチには、RNAおよび/またはcDNA誘導体の直接分析、および in vitroミニ遺伝子スプライシングアッセイが含まれる。

PS4 PM2 BA1 BS1 BS2 Variant Frequencyと対照集団の使用

対照群または一般集団における変異体の頻度を評価することは、その潜在的病原性を評価するのに有用である．これは，公的に利用可能な集団データベース(例えば，1000ゲノム，NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) Exome Variant Server，Exome Aggregation Consortium (ExAC);表1参照)を検索すること、ならびに文献にしばしば発表されるラセマッチドコントロールデータを使用することによって達成され得る。ESPデータセットは，白人およびアフリカ系アメリカ人集団に有用であり，変異体が存在しないかどうかを判定するためのカバレッジデータがある。1000ゲノムデータは変異体の欠如の評価には使用できないが、異なる人種集団をより広く表している。さらに最近、ExACは、ESPデータの約2/3を含む多様な集団集団から>60,000個のエキソムからの対立遺伝子頻度データを発表した。一般に対照集団の対立遺伝子頻度がこの疾患で予想されるよりも大きい場合(表6)は、まれなメンデル型疾患(BS1)の良性解釈を強く支持するものと考えられ、5%を超える場合は独立した支持(BA1)とみなされる。さらに、調査中の疾患が若い時期に完全に浸透し、その変異体が観察されるのが劣性(ホモ接合型)、優性(ヘテロ接合型)、またはX連鎖(ヘミ接合型)の健康な成人であることがよく立証された場合、これは良性解釈(BS2)の強力な証拠と考えられる。

変異体が存在しない場合、データベースの読み取り深度が変異体部位での正確な呼び出しに十分であることを確認すべきである．大規模な一般集団または対照コホート(>1000個体)に変異体が認められず(劣性の場合は予想される保菌頻度未満)、その集団が同定された変異体を保有する患者に人種適合している場合、この観察結果は病原性に関する中等度の証拠(PM2)とみなすことができる．しかしながら、多くの良性変異株は「個人的」(個人または家族に特有)であり、したがって人種をマッチさせた集団における欠如は、病原性を示す十分な証拠または強力な証拠すらないと考えられる。

症例対照比較のための集団データの利用は、集団の表現型がよくわかっており、頻度の差が大きく、研究中のメンデル病が早期に発症している場合に最も有用である。
検査のために臨床検査室に紹介された患者には，疾患を「除外」するために送付された個人が含まれる可能性が高く、したがって表現型がよく分類された症例ほど適格でない場合がある。
一般集団を対照コホートとして用いる場合，無症状の疾患を有する個人の存在は常に可能性がある。
しかしながら、これらのシナリオのいずれにおいても、症例対照の比較は差の検出に関して検出力が弱く、統計学的に有意な差を示すことは、上述のように病原性を裏付ける証拠を提供すると依然として仮定することができる。
対照的に特に極めてまれな変異型および浸透度の低い表現型では、統計的差がないことを慎重に解釈すべきである。

オッズ比(OR)または相対リスク(RR)は、遺伝子型(すなわち，変異体がゲノム中に存在する)と表現型(すなわち，疾患/転帰に影響される)との関連性の尺度であり、メンデル病または複合形質のいずれかに用いることができる。
本ガイドラインでは、メンデル病でのみその使用に取り組んでいる。RRはORとは異なるが、RRは小さい確率で漸近的にORに近づく。ORが1.0であることは、変異体が疾患を有するオッズに影響を及ぼさないことを意味し、1.0以上の値は変異体と疾患のリスクとの間に関連性があることを意味し、1.0以下の値は変異体と疾患のリスクとの間に負の関連性があることを意味する。

一般にわずかなメンデル効果サイズを有する変異体は3以上のORを有するが、浸透度の高い変異体は非常に高いORを有する(例:E3/E3ホモ接合体と比較したAPOE E4/E4ホモ接合体のORは13(wwww.tgen.org/data/neurogenomics)。
しかしOR周辺の信頼区間(CI)は、関連性の尺度自体と同じくらい重要である。CIが1.0を含む場合(例:OR=2.5，CI = 0.9-7.4)、関連性の主張はほとんど信頼できない。上記のAPOEの例では，CIは約10-16であった。

非常に簡単なオッズ比計算機(たとえばhttp://www.hutchon.net/ConfidOR.htmとhttp:// easycalculation.com/statistics/odds-ratio.php)がWebで利用できる。　27,28