SPAST遺伝子

遺伝子名:　SPASTIN; SPAST
別名:　SPG4 GENE; SPG4
染色体: 2
遺伝子座:　2p22.3
遺伝カテゴリー: Rare Single Gene variant-
関連する疾患：Spastic paraplegia 4, autosomal dominant 182601 AD

omim.org/entry/604277

SPAST遺伝子の機能

SPAST遺伝子差物はATP依存性の微小管切断タンパク質である。微小管切断は、細胞内の微小管配列の再編成や、核形成後の中心体からの微小管の離脱を促進すると考えられる。小胞体からゴルジ体への膜輸送と、細胞質分裂の脱落段階の完了に必要である。また、軸索の成長や軸索の枝の形成にも関与している可能性がある。SPASTの欠損は、常染色体優性4型痙性対麻痺（SPG4）の原因となっている。

Erricoら（2002）は、野生型あるいはATPase欠損型のスパスティンをいくつかの細胞型で発現させることにより、スパスティンが微小管と相互作用することを明らかにした。細胞骨格との相互作用は、スパスティンのN-末端領域によって媒介され、AAAドメインのATPase活性によって制御されていた。AAAドメインにミスセンス変異（604277.0001、604277.0002、604277.0004を含む）を導入すると、トランスフェクトした細胞では微小管との結合が恒常的になり、アスターの消失や核周囲の太い束の形成が誘導されたことから、スパスティンが微小管の動態に関与していることが示唆された。また、野生型のスパスティンは、トランスフェクトした細胞の微小管の分解を促進した。著者らは、スパスティンが、相同性の高い微小管切断タンパク質であるカタニン（606696）と同様に、微小管のダイナミクスに関与している可能性を示唆した。著者らは、スパスティンの変異により、長い軸索における微小管の細胞骨格の微細な制御が損なわれることが、遺伝性痙性対麻痺の病因になっているのではないかと考えた。

Ciccarelliら(2003)は、多重配列アラインメントにより、スパスティンと、アーミッシュタイプの遺伝性痙性対麻痺(SPG20; 275900)で変異している分子であるスパルティン(607111)に共通する約80アミノ酸のドメインを同定した。このドメインは、エンドソームでの輸送に役割を持つ分子の一貫した特徴として確立されているドメインを少し拡張したものである。スパスティンとスパルチンの両方が、微小管の相互作用に関与していると考えられる。Ciccarelliら(2003)は、このドメインにMIT(including into microtubule-interacting and trafficking molecules)という新しい記述名を提案し、このドメインが存在するすべての分子の主要な機能はエンドソーム輸送であると予測した。

McDermottら（2003）は、スパスティンを発現している神経細胞および非神経細胞において、野生型のタンパク質は細胞体の核周辺に局在しているのに対し、変異型のスパスティンは細胞骨格の染色と同様に細胞質全体に存在し、樹状突起ではなく軸索にまで及んでいることを明らかにした。この細胞にタンパク質を導入すると、正常なスパスティンは微小管を切断するタンパク質として働き、変異型スパスティンは微小管と共局するが切断はしないことが示唆された。変異体スパスティンの微小管との相互作用の異常は、ミトコンドリアやペルオキシソームの細胞内分布の異常と関連していた。McDermottら（2003）は、遠位軸索への輸送を含む、微小管細胞骨格上でのオルガネラ輸送の障害が、SPG4の主要な疾患メカニズムである可能性を示唆している。

Erricoら（2004年）は、スパスティンが動的な微小管を含む細胞領域に濃縮されていることを示した。細胞分裂時には、スパスティンは紡錘体極、中心紡錘体、中間体に見られ、一方、不死化した運動ニューロンでは、遠位軸索と分岐点に濃縮されていた。スパスティンは、中心体タンパク質であるNA14 (SSNA1; 610882)と相互作用し、γ-チューブリン (TUBG1; 191135)と共重合していた。NA14との結合に必要な領域を欠損させると、スパスティンと微小管との相互作用が阻害されることから、NA14はスパスティンの活動を中心体で制御するための重要なアダプターである可能性が示唆された。Erricoら（2004）は、スパスティンが細胞骨格の再編成とダイナミクスに役割を果たしているのではないかという仮説を立てた。

Reidら（2005）は、酵母2ハイブリッド法を用いて、ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）-III複合体に関連するタンパク質であるCHMP1B（606486）が、スパスティンの結合パートナーであることを突き止めた。CHMP1Bとスパスティン蛋白質は、トランスフェクトした細胞で明らかに細胞質内でコロケーションを示した。CHMP1Bとスパスティン蛋白質は、in vitroおよびin vivoの相補的なアッセイで特異的に相互作用し、スパスティンはCHMP1Bと共沈した。この相互作用は、スパスティンの80残基から196残基の間にあるMITドメインを含む領域によって媒介されていた。エピトープタグ付きのCHMP1Bを哺乳類細胞に発現させると、ATPase-defective spastinの発現に伴う微小管異常の表現型の発現が抑制された。著者らは、細胞内の膜交通現象におけるスパスティンの役割を示唆し、細胞内の膜交通の欠陥が運動ニューロンの病理の重要な原因である可能性を提案した。

Svensonら（2005）は、SPAST遺伝子のエクソン6の一部に対応する新規の抗血清を開発し、すべてのスパスティンアイソフォームに特異的であった。この試薬を用いて、著者らは、内因性のスパスティンが、細胞周期のすべての時点で、さまざまな種類の細胞の中心体に位置していることを発見した。スパスティンは、微小管を解重合した後も中心体に局在しており、これはスパスティンが中心体に不可欠なタンパク質であることを示唆している。スパスティンは、ラット海馬ニューロンの樹状突起、軸索、グリア突起にも濃縮されて存在していた。Svensonら（2005）は、スパスティンが微小管の力学と組織化に役割を果たしていると結論づけている。

一方、Evansら（2006）とSandersonら（2006）は、スパスティンのN末端ドメインがアトラスチン（ATL1; 606439）のC末端細胞質ドメインと直接結合していることを明らかにし、この2つの遺伝子産物が共通の生物学的経路で相互作用していることを示唆した。Evansら（2006）は，HeLa細胞を用いた酵母2-ハイブリッド解析と共免疫沈降法を，Sandersonら（2006）は，ヒト胎児脳cDNAライブラリを用いた酵母2-ハイブリッド解析と，HeLa細胞，HEK293T細胞，マウスNSC34神経細胞を用いたタンパク質のプルダウン，共免疫沈降法，共局在化法を行った。

Mannanら（2006）は、マウスの線維芽細胞（NIH3T3）とHeLa細胞を用いたyeast 2-hybrid解析と共沈法により、スパスティンが、主に小胞体に発現しているreticulon-1（RTN1; 600865）と相互作用することを明らかにした。この相互作用は、微小管との相互作用および輸送ドメインを含むスパスティンのN-末端領域を介して行われる。また、細胞内の分布を調べたところ、2つのタンパク質は細胞質内の小胞の中でコロケーションをとっていることがわかった。この結果は、細胞内小胞輸送プロセスの障害が痙性対麻痺の原因ではないかという仮説を補強するものであった。

また、Montenegroら（2012）は、免疫沈降法を用いて、スパスティンがRTN2B（603183）と相互作用することを明らかにした。ATPaseを欠損したスパスティンを細胞に発現させると、小胞体が異常に太く伸長した微小管束の上に再配置され、RTN2Bもこの微小管束の上に再配置された。この結果から、RTN2は、REEP1（609139）、アトラスチン-1（ATL1；606439）、スパスティンなどのヘアピンループを含むERモルフォゲンのネットワークに参加していることがわかった。

Vietriら（2015）は、受容体の選別、ウイルスの出芽、サイトカイン、および細胞膜の修復の際に膜の収縮とシーリングを促進するESCRT-III複合体が、アナフェイズ後期に再構築される核膜に一過性にリクルートされることを示した。ESCRT-IIIとその制御因子であるAAA（ATPase associated with diverse cellular activities）ATPase VPS4 (609982)は、ESCRT-III様タンパク質CHMP7 (611130)によって、再形成された核膜が紡錘体微小管を巻き込む場所に特異的にリクルートされる。その後、もう一つのESCRT-III様タンパク質であるIST1 (616434)が結合すると、AAA ATPaseであるスパスティン (604277)が微小管を切断するために直接リクルートされる。スパスティンの機能が阻害されると、紡錘体の解体が阻害され、ESCRT-IIIの核膜への局在が拡大することになる。アナフェイズでESCRT-IIIの機能が阻害されると、微小管の分解が遅れ、核の完全性が損なわれ、その後の間期でDNA損傷病巣が出現する。Vietriら（2015）は、ESCRT-III、VPS4、およびスパスティンが協力して、有糸分裂の終了時に核膜と微小管の交差部位で核膜の封鎖と紡錘体の分解を調整し、核の完全性とゲノムの保護を確保していることを提案しており、その仕組みは細胞運動による脱落と驚くほど類似している。

SPAST遺伝子の発現

Hazanら（1999）は、染色体2p22-p21上の痙性対麻痺-4（SPG4；182601）候補領域に基づいたポジショナルクローニング戦略を用いて、AAAタンパク質ファミリー（601681）のメンバーをコードする遺伝子を同定し、これを「スパスティン」（SPAST）と命名した。推論されたスパスティンタンパク質は616個のアミノ酸を含み、分子量は約67.2kDである。AAAカセットは、アミノ酸342と599の間に位置している。3つの保存されたATPaseドメインにはWalkerモチーフAとBが含まれている。スパスティンとそのAAAサブグループの関連メンバーはロイシンジッパーモチーフを含んでおり、スパスティンではアミノ酸位置50-78と508-529に存在している。スパスティンのC末端はAAAファミリーのいくつかのメンバーと強い相同性がある。スパスティンとミトコンドリアのメタロプロテアーゼのアミノ酸配列を比較すると、相同性はAAAカセットに限定されることがわかった。スパスティンはパラプレジン(60278)とアミノ酸位置342と599の間で29%の相同性しか示さない。パラプレジンは酵母のAfg3pと同じ領域で57%の相同性を示すことから、スパスティンはパラプレジンや他のメタロプロテアーゼと同じAAAサブファミリーには属していないことが示唆される。SPASTはヒトの成人および胎児の組織でユビキタスに発現しており、胎児の脳ではわずかに高い発現を示している。

Hazanら（1999）は、SPASTのマウスオルソログをクローニングした。このオルソログは、アミノ酸113と616の間でヒトSPASTと96%の配列同一性を持つ。スパストの転写産物は、マウスの成体組織および胚の7日目から17日目までの間に、ユビキタスに発現している。

Beetzら（2004）は、新しいレポーターシステムを用いて、ヒトのスパスティンに2つの独立した機能的核局在化配列を同定した。

SPAST遺伝子と自閉症スペクトラム障害ASDの関係

SPAST遺伝子は、ASDの症例で遺伝子破壊につながるバランス型染色体異常（BCA）が確認されたことを受けて、ASDの候補遺伝子として同定された（Talkowskiら、2012年）。このBCAで破壊された遺伝子は、同じ報告書の追跡調査でも、症例対照のCNV負担や、神経発達障害（NDD）の症例で最低3つのCNVが存在し、対照では1つも存在しないことから、個別に関与していることが判明した。この遺伝子は、Simons Simplex Collection（SSC）とAutism Sequencing Consortium（ASC）の統合データセットのTADA（transmission and de novo association）解析により、ASDリスクに影響を与える可能性の高いバリアントが強く濃縮された遺伝子として、false discovery rate（FDR）が0.1未満で同定された（Sanders et al.2015）。この遺伝子で同定されたバリアントの中には、de novo loss-of-function（LoF）バリアントが1つ含まれていたという。

SPAST遺伝子とその他の疾患との関係

遺伝性痙性対麻痺（HSP）4型

Hazanら(1999)は、痙性対麻痺の14家族の各1人と対照群の6人から、スパスティンのオープンリーディングフレーム全体に渡るオーバーラップしたcDNA断片を増幅し、配列を決定した。この手法により、604277.0001〜604277.0005の5つの痙性対麻痺の家族（SPG4; 182601参照）にヘテロ接合の突然変異があることが確認されました。また、スイスの同じ地域に住む血縁関係のない3人の罹患者は、SPASTのイントロン15のアクセプタースプライスサイトに変異を持つヘテロ接合体でした（604277.0005）。

Fonknechtenら（2000）は、87人の血縁関係のない常染色体優性遺伝性痙性対麻痺患者のDNAを分析し、SPG4遺伝子のコーディング領域に散在する34の新規の変異を検出した（604277.0007および604277.0008など参照）。その結果、ミスセンス（28％）、ナンセンス（15％）、スプライスサイトポイント（26.5％）の各変異に加え、欠失（23％）と挿入（7.5％）が見つかりました。238人の変異キャリアのうち6％は無症状で、20％は自分の症状に気づいていなかったことから、浸透性は低いと考えられた。また、ミスセンス変異とトランケーション変異では、発症年齢や重症度に違いはありませんでした。

Burgerら（2000年）は、ドイツの常染色体優性遺伝性痙性対麻痺の家族において、4つの新規SPG4変異を同定したが、そのうちの1つの大家族については以前から予測が提案されていた（Burgerら、1996年）。この家族では、三塩基反復の拡大は認められず、代わりにD441Gミスセンス変異（604277.0009）が認められたことから、著者らは、臨床的に観察された先天性は確認バイアスによるものであると推定した。

Svensonら（2001）は、SPG4遺伝子座への連鎖と一致する15家族のスパスティン遺伝子の変異をスクリーニングし、11の変異を同定したが、そのうち10は新規のものであった（例えば、604277.0011-604277.0012を参照）。変異のうち5つは、不変のスプライスジャンクション配列にあった。患者のmRNAをRT-PCRで解析したところ、これら5つの変異はいずれもスプライシングに異常をきたしていた。また、1つの変異は「リーキー」、すなわち部分的に浸透していることが判明し、その変異アリルは変異型（スキップされたエクソン）と野生型（完全長）の両方の転写物を産生した。少なくとも1つのリーキーな突然変異が存在したことから、野生型スパスティンの発現レベルの比較的小さな違いが、機能的に大きな影響を与えることが示唆された。このことは、SPG4に関連したSPGを持つ家族の間で、あるいは家族内で、発症年齢、症状の重さ、症状の進行速度に大きな差があることを、少なくとも部分的には説明しているのかもしれない。

Sauterら（2002）は、ドイツの161の血縁関係のない家系のSPG患者のスパスティン遺伝子を解析し、27の家系で突然変異を発見した。これらの変異のうち、これまでに報告されていたのは3つだけで、2つの家系で発見されたのは1つだけであった。検出された変異の中には、フレームシフト変異が14個、ナンセンス変異が4個、ミスセンス変異が4個、複数のエクソンにまたがる大きな欠失が1個、スプライス変異が4個ありました。新規変異のほとんどは、スパスティン遺伝子の保存されたAAAカセットをコードする領域に位置していた。ドイツの遺伝性痙性対麻痺患者の非選択グループにおけるスパスティン遺伝子変異の相対的な頻度は約17％であり、フレームシフト変異がこの集団におけるSPG4変異のほとんどを占めていた。スプライス変異の割合は、他で報告されているものよりもかなり低かった(Lindsey et al., 2000; Svenson et al., 2001)。

Meijerら（2002）は、遺伝性痙性対麻痺（HSP）を持つ北米の76人の非血縁者のうち15人において、SPG4遺伝子に5つの既報の変異と8つの新規変異を同定した：4つのミスセンス変異、1つのナンセンス変異、1つのフレームシフト変異、2つのスプライスサイト変異。

Charvinら（2003）は、抗スパスティンポリクローナル抗体を用いて、ヒトとマウスの両方の組織で75kDと80kDの2つのアイソフォームを同定し、アイソフォームの比率は組織によって異なることを明らかにした。スパスティンは神経組織に豊富に存在するタンパク質で、免疫蛍光顕微鏡による解析では、神経細胞には発現しているが、グリア細胞には発現していないことが明らかになった。これらのデータは、SPG4遺伝子変異に伴う軸索の変性は、神経細胞の一次欠損によって引き起こされる可能性を示唆している。SPG4のナンセンス変異またはフレームシフト変異を持つ患者のタンパク質および転写産物の分析では、切断されたタンパク質も変異した転写産物も見られなかったことから、これらの変異がスパスティンの機能喪失の原因となっていることがさらに明らかになった。

Svensonら(2004)は、SPG4遺伝子に2つの稀な多型を同定した：ser44→leu(S44L; 604277.0015)とpro45→gln(P45Q; 604277.0017)。SPG4遺伝子を持つ4つの家系では、病気の原因となるSPG4遺伝子の突然変異（604277.0016; 604277.0018など）に加えて、S44LまたはP45Qの多型が存在すると、病気の発症年齢が早まることがわかった。Svensonら(2004)は、S44LとP45Qの多型は単独では良性であるが、他のSPG4の突然変異と一緒に存在するとSPG4の表現型が変化すると結論付けている。

Parkら（2005年）は、韓国人の痙性対麻痺患者18人のうち8人において、SPG4遺伝子に8種類の異なる変異を確認した。8人の患者のうち7人には、この疾患の家族歴がありました。SPG3A遺伝子（ATL1; 606439）には変異が確認されませんでした。

Brugmanら（2005年）は、下肢に限局した成人発症の上肢運動ニューロン症状を有する47人の非血縁者のうち、6人（13％）にSPG4遺伝子の6つの変異を同定しました。7番目のSPG4遺伝子変異は、急速に進行する痙性四肢麻痺と仮性硬直性構音障害を有する34歳の女性で確認され、筋萎縮性側索硬化症（ALS；105400参照）と診断された。しかし、腕や上腕部に上肢運動ニューロンの病変を有する51名の患者では、スパスティン変異が確認されなかったことから、スパスティン変異はALSの一般的な原因ではないと考えられた。

Crippaら（2006）は、純遺伝性痙性対麻痺（HSP）のイタリア人患者50人のうち、血縁関係のない13人（26％）において、SPG4遺伝子に8つの新規変異を含む12の異なる変異を同定した。解析した家族性の5例すべてにSPG4遺伝子の変異が認められたことから、常染色体優性のHSPの最も一般的な型は、この遺伝子の変異によって引き起こされることが確認された。また、45名の散発性患者のうち8名（18％）にSPG4の変異が認められました。さらに10人の複雑なHSP患者では変異が確認されなかった。遺伝子型と表現型の相関関係は認められなかった。

常染色体優性のSPG患者121名のうち、DHPLCでSPG4遺伝子の変異が検出されなかった24名（20％）について、Depienneら（2007年）は、MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification）を用いて、SPG4遺伝子に16個の異なるヘテロ接合のエキソン欠失を同定した。欠失の大きさは、1エクソンからコーディング配列全体まで様々であった。欠失のある患者は、点変異のある患者と同様の臨床表現型を示したが、発症年齢は早かった。この結果から、SPG4のハプロ不全が常染色体優性SPGの主要な原因であること、また、エクソンの欠失が変異陰性のSPG4患者の大部分を占めることが確認され、適切な臨床シナリオに遺伝子量の研究を含めることが正当化された。Depienneら（2007）は、SPG4遺伝子にはこれまでに150以上の異なる病原性変異が確認されていると述べています。

McDermottら（2006年）は、285人の痙性対麻痺患者のうち53人（19％）に、27の新規変異を含む44の異なるSPG4遺伝子の変異を同定しました。大半の変異は、保存されたAAAカセット内で発生しているか、AAAカセット内での早発終了やミスプライシングを引き起こすと予測された。ヘテロ接合のS44L変化は、285人のSPG患者のうち8人（2.8％）と健常対照者の3.1％で確認され、多型であることが示された。

Beetzら（2006年）は、直接塩基配列を調べた結果、これまでスパスティン変異陰性とされていた65人の痙性対麻痺患者のうち、12人（18％）にSPG4遺伝子の部分欠失を同定した。著者らは、スパスティンの部分的な欠失がハプロ不全を介して作用することを示唆している。Beetzら（2007年）は、MLPA解析を用いて、SPG4遺伝子の部分欠失を、その領域に関連していたが、突然変異スクリーニングでは変異が確認されなかった8家族のうち7家族で同定した。これらの家族は、Lindseyら（2000年）、McMonagleら（2000年）、Meijerら（2002年）、Svensonら（2001年）によって報告されていた。この発見は、SPG4の大きなゲノム欠失は珍しいことではなく、常染色体優性のSPGのワークアップの一環として行うべきであることを示している。

Beetzら（2007年）は、SPG4遺伝子のエクソン1の欠失によって痙性下垂症が発症した家族を報告した。また、プロバンドとその兄はSPG3A遺伝子の欠失を有していたが、SPG3Aの欠失は息子たちには遺伝せず、障害の重症度にも明らかな影響はなかった。この結果から、SPG4の発症メカニズムはハプロ不全であり、SPG3Aの発症メカニズムはドミナントネガティブであることが示唆された。

Shoukierら（2009年）は、ドイツ人を中心とした血縁関係のない200人のSPG患者のうち、57人（28.5％）にSPG4の変異を同定しました。その結果、29個の新規変異を含む47個の異なる変異が同定された。報告されている他の変異を検討した結果、ほとんど（72.7％）の変異がC末端のAAAドメインに集まっていることがわかった。しかし、MITドメイン、MTBD、およびN末端領域（228～269残基）にも変異が見られた。57人の患者のコホートでは、遺伝子型と表現型の間に暫定的な相関関係が認められ、ミスセンス変異が疾患の早期発症と関連していることが示された。