ddPCR  液滴デジタルPCR Droplet Digital PCR

デジタルPCRとは?

デジタルポリメラーゼ連鎖反応(デジタルPCR、DigitalPCR、dPCR、またはdePCR)は、DNA、cDNA、またはRNAを含む核酸鎖を直接定量し、クローン増幅するために使用することができる従来のポリメラーゼ連鎖反応法の改良版です。
dPCRと従来のPCRの重要な違いは、核酸量を測定する方法にあり、dPCRはPCRよりも正確な方法でありますが、経験の浅い試験者が扱うと誤りが生じやすくなります。
「デジタル」測定では、ある変数を定量的かつ離散的に測定しますが、「アナログ」測定では、測定されたパターンに基づいて特定の測定値を外挿します。
PCRは、1つのサンプルにつき1つの反応を実行します。
dPCRはまた、試料内で単一の反応を行うが、試料は多数の分配に分離され、反応は各分配された試料内で個別に行われ、この分離により、より信頼性の高い核酸量の収集と高感度の測定が可能となります。この方法は、コピー数変異体や点突然変異などの遺伝子配列の変異を研究するのに有用であることが実証されており、次世代シークエンシングのための試料のクローン増幅に日常的に使用されています。

液滴デジタルPCRとは?

液滴デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べては高精度、高感度に定量を行う新しいPCR技術をいいます。
定性のみ、つまりあるかないかだけの通常PCR。
それに対して検量線で相対的に定量が可能なリアルタイムPCR。
そして、絶対定量が行えるデジタルPCRを第3世代PCRと呼びます。
デジタル PCR (ddPCR) は、水-油エマルジョン液滴技術に基づくデジタル PCR を実行するための方法です。サンプルは 20,000 個の液滴に分画され、テンプレート分子の PCR 増幅は各液滴で行われます。 ddPCR 技術では、ほとんどの標準的な TaqMan プローブベースのアッセイに使用されるものと同様の試薬とワークフローを使用します。大規模なサンプル分割は ddPCR 技術の重要な側面です。

Droplet Digital PCR技術は、水-油エマルジョン液滴システムを利用したデジタルPCR法です。水-油エマルジョン中に液滴を形成し、鋳型DNA分子を分離するための仕切りを形成します。液滴は、PCR反応が行われるプレート内の個々の試験管やウェルと本質的に同じ機能を果たしますが、はるかに小さい形式ではありますが。大規模なサンプル分割は ddPCR 技術の重要な側面です。

Droplet Digital PCRシステムは、核酸サンプルを数千個のナノリッターサイズの液滴に分割し、PCR増幅を各液滴内で行います。この技術は、市販されている他のデジタルPCRシステムに比べてサンプル数が少ないため、コスト削減と貴重なサンプルの保存が可能です。

サンプルのパーティショニングは、液滴デジタルPCRの鍵となります。従来のPCRでは、1つのサンプルで1回の測定しかできませんでしたが、液滴デジタルPCRでは、サンプルが20,000ナノリッターサイズの液滴に分割されます。このパーティショニングにより、1つのサンプル内で何千もの独立した増幅イベントの測定が可能になります。

ddPCR はどのように機能するのか?

ddPCR テクノロジーは、マイクロ流体と独自の界面活性剤を組み合わせて、PCRサンプルを油を含んだ水滴に分割します( Hindson et al. 2011)。この液滴は、その中に含まれるテンプレート分子のPCR増幅をサポートし、ほとんどの標準的なTaqManプローブベースのアッセイに使用されているものと同様の試薬とワークフローを使用しています。PCRに続いて、各液滴を分析または読み取り、元のサンプル中のPCR陽性液滴の割合を決定する。これらのデータは、ポアソン統計を使用して分析され、オリジナル サンプル中のターゲット DNA テンプレート濃度が決定されます。

デジタルPCRは、試料中の核酸の絶対定量を可能にしますが、デジタルPCR実施のための拡張可能で実用的な技術の欠如は、この本質的に強力な技術の広範な採用を妨げていました。そこで、96ウェルプレートワークフローによる従来のTaqManアッセイを用いて∼200万のPCR反応の処理を可能にするハイスループット液滴デジタルPCR (ddPCR)システムにが開発されました。
3つの応用は、本発明者らのddPCRシステムによって与えられる大規模な分配が、リアルタイムPCRよりも桁違いに高い精度と感度を提供することを実証しています。
まず、生殖細胞系列コピー数変異の正確な測定が可能となりました。
第二に、まれな対立遺伝子について、野生型バックグラウンドに対して100000倍過剰になっている突然変異DNAを高感度に検出しました。
第三に、Hindsonらは、セルフリーDNAからの循環胎児および母体DNAの絶対定量を実証しました。
このddPCRシステムにより、研究者が複雑な遺伝的状況を探索し、新たな疾患関連を発見し検証し、分子診断の新たな時代を定義することが可能になると予想されています。

他のデジタルPCR技術と比較したddPCR の利点

液滴デジタルPCRは、従来のデジタルPCR実装のためのスケーラブルで実用的な技術の欠如を解決することで、以前のデジタルPCR技術の性能を凌駕しています。シリアル希釈は手間がかかり、ピペッティングエラーが発生する可能性があります。液滴デジタルPCRは、1つのステップで液相中のサンプルを大規模に分割することで、これらの欠点に対処します。数万個の液滴を生成することで、1つのサンプルで1つの結果ではなく、数万個のデータポイントを生成することができ、デジタルPCRに固有の統計解析のパワーを実用化することができます。

液滴デジタルPCRの利点

ddPCR 技術は、デジタル PCR の特徴である感度と精度を維持しながら、他の方法に比べてサンプルと試薬の使用量を減らし、全体的なコストを削減する方法で、ハイスループットのデジタル PCRを可能にします。
ddPCR 技術の利点には以下のようなものがあります。

絶対定量

ddPCR 技術は、標準曲線を実行する必要がなく、入力サンプルあたりのターゲット DNA コピーの絶対数を提供するため、この技術はターゲット DNA の測定、ウイルス負荷分析、および微生物の定量に理想的です。

他に類を見ない精度

ddPCRによる大規模なサンプル分割により、サンプル間のターゲットDNA配列コピー数の小さな倍数差の信頼性の高い測定が可能になります。

高いS/N比

ハイコピーテンプレートとバックグラウンドが希釈され、標的陽性部分のテンプレート濃度が効果的に濃縮されるため、まれな標的の高感度検出が可能になり、±10%の精度で定量が可能になります。

PCRバイアスの除去

qPCRの増幅効率に依存していたものを除去することでエラー率を低減し、小さな(1.2倍)差の検出を可能にします。

簡素化された定量化

絶対定量化には校正標準物質も標準物質も必要ありません。

消耗品コストの削減

反応量はピコリットルからナノリットルの範囲で、試薬の使用量と各データポイントに必要なサンプル量を削減します。

装置コストの低減

エマルジョンベースの反応システムは、複雑なチップやマイクロ流体を使用せずに、標準的なサーマルサイクラーでPCR反応を行うことができることを意味します。

優れたパーティショニング

ddPCR テクノロジーは、チップベースのデジタル PCR システムが数百または数千のパーティションしか生成しないのに対し、96 ウェルプレートでは、20µlのサンプルあたり 20,000 個の液滴を生成し、ほぼ200万個のパーティショニングされたPCR反応を生成します。パーティションの数が多いほど、より高い精度が得られます。

液滴デジタルPCRのワークフロー

ddPCRの説明図

(a)試料および液滴生成油を8チャンネル液滴発生器カートリッジに装填する。
(b)液滴ウェルに減圧をかけると、流動集束ノズルを通して試料と油を吸引し、そこで1nLの単分散液滴が形成される。2分未満で、8つの試料を20 000滴の8セットに変換する。
(c)界面活性剤安定化液滴を96ウェルPCRプレートにピペット移す。
(d)エンドポイント(35-45サイクル)までの液滴PCR増幅は、従来のサーマサイクラーで実施される。
(e)プレートを各ウェルから液滴を飲み込むリーダーに装填し、毎秒∼1 000の速度で2色検出器を通過して単一ファイルを流す。
(f)液滴は、その蛍光振幅に基づいて正または負として割り当てられる。
各チャネルの正および負の液滴の数を用いて、標的および参照DNA配列の濃度およびそれらのポアソンに基づく95%信頼区間を算出する。

ddPCRの論文|DNAコピー数の絶対定量のためのハイスループット液滴デジタルPCRシステム

抄録

PCRを用いた特定の核酸配列の検出および定量は、多数の研究および増えつつある分子診断検査の基本である。
PCR利用者の第1世代は、定性的結果を得るためにゲル電気泳動によるエンドポイント分析を行った。
real-time PCRの出現により、蛍光プローブを用いて各サイクル後の増幅の進行をモニタリングすることにより定量が可能となる第2世代が産卵された。リアルタイムPCRでは、信号がバックグラウンドを超えて増加するアナログ蛍光曲線上の点であるサイクル閾値(CT)から定量的な情報が得られる。未知の濃度を推定するためには、外部キャリブレーターまたは内因性対照に対する正常化が必要である。
不完全な増幅効率は、CT値に影響を及ぼし、その結果、絶対定量のためのこの技術の精度が制限される。
初期のパイオニア(1)は、限界希釈法、エンドポイントPCR法、ポアソン統計法を組み合わせることで、後にデジタルPCRとして知られるようになったアプローチである核酸濃度の絶対的測定値が得られる可能性があることを認識した。(2)
デジタルPCRでは、標的DNA分子は複数の複製反応を横切って分布し、鋳型をもたない反応や、1つ以上の鋳型コピーが存在する反応もある。
PCRの末端プラトー相への増幅後、1つ以上の鋳型を含む反応は正のエンドポイントを生じるが、鋳型を含まない反応は負のままである。
存在する標的DNA分子の数は、ポアソン統計量を用いて正のエンドポイント反応の割合から計算することができる。

λ=-ln(1-p)

ここで、λは複製反応あたりの標的DNA分子の平均数であり、pは正のエンドポイント反応の割合である。eq 1に従う。
λから、各複製PCRの体積および分析した複製の総数とともに、絶対標的DNA濃度の推定値を計算する。
デジタルPCRでは、複製、または分割の数は、標的DNA定量のダイナミックレンジを大部分規定し、そこでは、複製の数の一桁の増加は、ダイナミックレンジのおよそ一桁の増加を生じる。
また、分割数を増やすことで精度が向上するため、サンプル中の核酸配列間の小さな濃度差の解消が可能となる。(4)
これは、ピクセル数とデジタル画像の解像度の関係に似ています。
デジタルPCRは、各複製反応を陽性または陰性(それぞれ1または0)のいずれかとして割り当てるために2値エンドポイント閾値に依存するため、DNAコピー数推定に影響を及ぼすことなく、増幅効率の広い変動に耐えることができる。
その低スループットおよび制限されたダイナミックレンジにもかかわらず、マイクロウェルプレートにおける希釈を制限することによるデジタルPCRは、現在でも使用されている。(3)
実用的で低コストの実施形態は、デジタルPCRの可能性を解き明かし、PCR利用者および応用の第三世代を確立するであろう。
現在、市販のデジタルPCRシステムが用いているアプローチは2つある。
第1のアプローチは、マイクロウェル(5)またはマイクロ流体チャンバー(6~8)を用いて、試料を数百ナノリットルの区画に分割する。
マイクロ流体チップは反応設定を単純化するが、ハイスループットを達成するためのスケール化は困難である。
BEAMing,(9,10)と呼ばれる第2のアプローチはエマルジョンPCRに基づいており、そこではビーズの存在下で鋳型がクローン増幅される。
PCR後、エマルジョンを破壊してビーズを回収し、続いて蛍光ハイブリダイゼーションプローブで標識し、従来のフローサイトメトリーにより読み取る。
BEAMingは、ワークフローに複雑さを加える特殊な不均一なアッセイスキームを必要とし、それによって、その採用を、まれな対立遺伝子検出およびDNAメチル化を含む少数の応用に制限する。(11-13)
全体的に、高コスト、限られた処理能力、複雑なワークフローがデジタルPCRの採用を妨げている。
ハイスループットディジタルPCRを低コストで実用的なフォーマットで実現する可能性技術として油中水滴(14~16)を用いるアプローチを開発した。我々のアプローチは、単純なマイクロ流体回路と界面活性剤化学を利用して、20μLの試料と試薬の混合物を∼20000の単分散液滴(すなわち、区画)に分割する。
これらの液滴は、均一なアッセイ化学およびリアルタイムPCR応用に広く使用されているもの(すなわち、TaqMan)と同様のワークフローを用いた単一鋳型分子のPCR増幅を支持する。
自動液滴フローサイトメーターは、PCR後の液滴の各セットを1時間あたり32ウェルの速度で読み取る。

結果と考察

小滴デジタルPCR (ddPCR)のワークフローには、次のステップが必要です(図1)。鋳型、ddPCR MastermixおよびTaqMan試薬を含む8つの組み立てPCR反応を、単回使用の注入型カートリッジの個々のウェルにロードします。
次に、安定化界面活性剤を含む液滴生成油を負荷し、液滴発生器にカートリッジを配置する。
出口ウェルに真空を印加することにより、サンプルおよびオイルは、流動集束接合を通して引き出され、そこでは、毎秒~1000の速度で単分散液滴が生成される。
界面活性剤で安定化された液滴は、油相と水相の間の密度差のために急速に濃縮し、過剰な油の上に充填床を形成する、収集ウェルに流れる。
密に充填された液滴を、従来の96ウェルPCRプレートにピペット移し、終点まで熱サイクルする。
熱サイクリング後、プレートを液滴リーダーに移す。
ここでは、各ウェルからの液滴を吸引し、検出器に向かって流し、そこで、経路内で、スペーサー液の注入が分離し、単一ファイル同時2色検出のためにそれらを並べる。
TaqManアッセイは、標的遺伝子および参照遺伝子の特異的なデュプレックス検出を提供する。
すべての液滴は、稀な外れ値(例えば、ダブレット、トリプレット)を除外するために、検出器のピーク幅に基づいてゲート設定される。
各液滴は、陰性液滴の検出を可能にする蛍光発生プローブの不完全なクエンチングに起因する固有の蛍光シグナルを有する。
鋳型を含む小滴については、TaqManプローブの特異的切断により強い蛍光シグナルが発生する。
蛍光振幅に基づいて、単純な閾値は各液滴を正または負として割り当てる。
液滴体積が既知であるので、次いで、陽性液滴の画分を使用して、標的配列の絶対濃度を計算する。
20000滴については、絶対定量のダイナミックレンジは1コピーから∼100000コピーに及ぶ。
ヒトゲノムDNAについては、これは、20μL反応当たり3.3fgから330ngの範囲の入力DNA量に等しい。
テンプレートは液滴区画を横切ってランダムに分布するので、ポアソン補正はダイナミックレンジを平均して液滴あたり複数のコピーが存在する領域に広げる。
統計モデルを適用して、濃度推定値とその比の信頼限界を計算する(4, 17)

このddPCRシステムの当面の有用性を実証するために、著者らは、研究者に関心が高まっている3つの適用領域:コピー数変異(CNV)の決定、稀な対立遺伝子の検出および血漿中のセルフリーDNAの絶対定量に関するデータを提示する。
大量の液滴分配がデジタルPCRに与える明確な利点を強調するために、各用途を選択した。
CNVについては、多数の複製がコピー数状態を正確に測定するのに十分な精度を提供する。
まれな対立遺伝子の検出のために、標的変異DNAを高度に相同な野生型DNAから離して分割すると、感度が上昇する。
最後に、液滴分配は、外部キャリブレーターまたは内因性対照なしに、広いダイナミックレンジにわたって臨床試料からの核酸の正確な定量を可能にする。
CNVは、ヒトの広範な疾患に関与するとされている長さの数百から数百万塩基対に及ぶゲノムセグメントの欠失と増幅である。(18)マイクロアレイと次世代シークエンシング技術は、新しいCNVの発見を可能にし、加速した。(19)それによって、検証と追跡研究のためのダイナミックレンジを増加させた正確なCNV測定を行うための高スループット、低コストアプローチの必要性がさらに増加した。
マイクロアレイ技術はCNV発見のための貴重なツールであるが(20)、それらはダイナミックレンジが限られており、集団研究のための多数のサンプルにスケールするのに高価である。
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)(21)は、最大40の標的について欠失または重複の解消を可能にするアッセイであるが、新たな標的パネルについては、あらかじめ定義されたテストメニューからの選択または広範な先行アッセイの最適化を必要とする。
リアルタイムPCRに基づく方法を用いたCNV研究者は、正確なコピー数測定を得ることが技術的に困難であることを報告している。(22)
リアルタイムPCR測定は本質的に不正確であり、コピー数の推定値は症例と対照との間でドリフトする可能性がある。
ddPCRによりHapMap試料の生殖細胞系コピー数変異を測定した。
遺伝子コピー数の増加はしばしば縦列遺伝子重複の結果であるため、各配列がそれ自身の液滴にカプセル化され、別々にカウントされるように、標的遺伝子の連結されたコピーを予測可能かつ効率的に分離するために制限酵素を用いた。
制限酵素を選択して、既知の突然変異部位(23)およびメチル化感受性を回避するアンプリコン配列の両側を切断した。
超音波またはマイクロ流体装置を用いて物理的にせん断するDNAは、PCRによって増幅できる標的の量を減少させ、特殊な装置なしでハイスループットで実施することが困難であり得るため、魅力が少ない。
連鎖したコピー(24)を分離するための代替戦略であるプレ増幅は、標的遺伝子と参照遺伝子との間にバイアスを導入する可能性がある。
7つのHapMapサンプルについて、3つの標的遺伝子についてCNVのスクリーニングを行った。
それぞれのddPCR反応には、標的遺伝子および参照遺伝子に対するduplex TaqManアッセイ試薬が含まれていた。
MRGPRX1については、1から6までのコピー数状態は、各サンプルの単一ウェルの結果から完全に解消された(図2a)。
CYP2D6およびX染色体に対するより低いCNV状態も、示されるように容易に解消された。
13のHapMapサンプルについて、我々のシステムはHIV-1/AIDS感受性に関連する遺伝子であるCCL3L1のコピー数を推定した(18)(図2b)。
DNAサンプルNA18507について、次世代シークエンシングはCCL3L1コピー数を5.7(25)と推定したが、著者らのddPCRシステムは6.05と推定した。
5.7という推定値は、次世代シークエンスランの何十億もの読み取りが全ゲノムに分布しているため、平均的な読み取り深度はわずか30×であるため、サンプリング不足による可能性が高い。
したがって、いったん標的遺伝子が同定されると、ddPCRでは読み取り数をほぼ任意にスケールできるので、より高い精度が容易に達成できる。
現在のddPCRシステムは、1つのウェルからの2つの遺伝子に対して最大20000×の読み取り深さを達成することができる。
これらのデータは、我々のddPCRシステムがCNV集団研究に十分に適していることを示している。というのは、これにより、より小さな遺伝子セットに対して多数のサンプルを検査することが可能になるからである。
図2

図2.液滴デジタルPCRによるコピー数変動状態の決定
(a)MRGPRX1、X染色体、CYP2D6、および(b) CCL3L1のHapMapサンプルにおける測定コピー数変動状態
(c)正常および腫瘍性乳房組織から抽出したDNAにおけるGRB7およびERBB2の測定コピー数変化の相関
各マーカーは∼20000滴の単一ddPCRウェルからのCNV測定を表す。
エラーバーは各コピー数決定のポアソン95%信頼区間を示す。
サンプルの不均一性は、コピー数増幅の測定を減弱させることができ、これは、正常とのより小さな差異を識別するためにより正確な測定を必要とする。
体細胞コピー数の変化は多くの癌の特徴である。
正確なコピー数定量のためのハイスループット技術がなければ、病理医は、この技術が単一細胞分解能をもたらすので、増幅および欠失を診断するために蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を使用する。
FISHおよび関連技術は高価で、労力を要し、他の分析因子による性能の大きな損失を受けやすい。(26)
特異的増幅は腫瘍サブタイプを定義し、治療の指針となる。
例えば、Her2陽性乳房腫瘍はトラスツズマブ(ハーセプチン)に反応する。
正常および腫瘍乳房組織サンプルのセットについて、ERBB2およびGRB7の測定コピー数は、GRB7増幅が低いことを示した2つのサンプルを除いて相関した(図2c)。
これらの結果は、GRB7遺伝子がHER2アンプリコンの一部であり、17q11-21増幅を伴うほぼ全ての乳房腫瘍において同時増幅されることから期待された(27, 28)。(このddPCR法は、複製ウェルを組み合わせることにより、不均一な混合物における微細コピー数差を解消するための分割数をスケールする能力を提供し、より効率的な診断検査の基礎を予見できる。
第2の適用は、高度に相同な野生型DNAバックグラウンドの存在下で起こる競合的PCRプロセスを劇的に減少させることによって、稀な突然変異対立遺伝子の検出の改善を実証する。
慎重な最適化により、real-time PCR法は1%突然変異体画分まで検出できる。
同じアッセイで、ddPCRは競合するバックグラウンドを変異体から離して分割し、変異体対野生型の平均比率を20000倍に効果的に増加させた。
平均して、PCR反応当たりの突然変異体分子の効果的な濃縮は、使用される試料分割の数に比例する。
BRAF V600Eミューテーションを対象とした二重税TaqManアッセイについて(29)は、リアルタイムPCRより1000倍低い0.001%のミュータント部分を検出するドロレット分割を示した(図3および補足表1および補助図1)。
臨床サンプルから回収された量に依存して、より多くのDNAをddPCRシステムに負荷して、検出限界をさらに低いレベルまで押し下げることができる。
このアプローチにより、研究者らは極めて低レベルの突然変異体を測定することができ、これにより微小残存病変の検出が改善され、侵襲性の低い診断法が可能となる。

次に、臨床検体中のDNAを定量するこのddPCRシステムの能力を評価した。
セルフリー血漿(30)中の循環DNAは、非侵襲性出生前(31)および腫瘍(32)診断を開発するためのサンプルタイプとして注目されるレベルが増加している。
血漿中の無細胞DNAは高度に断片化しており(33)、低レベルで存在し、定量の課題となっている。
母体無細胞形質中の胎児と全DNAを列挙した。
妊娠10~20週齢の間に採取した19の母体血漿サンプルについて、胎児のレベル(図4a)および全DNA (図4b)を、雌雄両方の胎児について測定した。
選択的メチル化感受性消化物は、著者らのddPCRシステムを用いて、低レベルの高メチル化RASSF1胎児DNA(34)を正確に定量することを可能にした。
SRY、RASSF1、総DNA濃度の絶対測定値で、各サンプルの胎児負荷量を算出した(Figure 4c)。
男性胎児については、高メチル化RASSF1胎児DNAとSRY胎児負荷の間の93.7%の相関が、女性胎児の推定値の信頼性を提供した。
RASSF1のみに基づいて、胎児負荷量は2.1~11.9%であり、現在、男性胎児からの胎児負荷量の推定に限定されている次世代シークエンシング(35)によって収集されたデータと概ね一致していた。
この応用は、臨床試料中の高度に断片化されたセルフリーDNAの絶対定量の能力を実証する。
全体として、これらのデータは、ddPCRが高スループットでDNAコピー数の正確な推定を実現する実用的な解決法を提供することを示す。
このシステムは、デジタルPCRの固有のパワーを、多くの応用のためにより多くの研究者に解放することを期待する

Droplet Digital PCRのワークフロー

ddPCRのワークフローを図1に示した。TaqMan PCR反応混合物を、2× ddPCR Mastermix (Bio-Rad)、20×プライマー、およびプローブ(それぞれ最終濃度900および250 nM)および鋳型(可変容積)から、20μLの最終容積で組み立てた。
次に、各集合ddPCR反応混合物を8チャンネルディスポーザブル液滴ジェネレータカートリッジ(Bio-Rad)のサンプルウェルに装填した。
液滴発生油(Bio‐Rad)60μLの容量を各チャンネルの油井に負荷した。
カートリッジを液滴発生器(Bio-Rad)に入れた。
カートリッジを液滴発生器から取り出し、そこで液滴ウェルに集めた液滴を、次にマルチチャンネルピペットで96ウェルPCRプレートに手動で移した。
プレートをホイルシールでヒートシールし、次いで通常のサーマルサイクラー上に置き、終点(40~55サイクル)まで増幅した。
PCR後、96ウェルPCRプレートを液滴リーダー(Bio-Rad)に装填した。この液滴は、プレートの各ウェル(32ウェル/h)から自動的に液滴を読み取る。
ddPCRデータの解析は、液滴リーダーに付属するQuantaSoft解析ソフト(Bio-Rad)を用いて行った。
HapMap試料中のコピー数変動の測定
MRGPRX1、ChromosomeX、CYP2D6について、各精製ヒトゲノムDNA試料(Coriell)4.4μgをRsaI (NEB)10単位で50μLで1時間37℃で消化した。
消化物をTE緩衝液(pH 8.0)で8倍から400μLに希釈し、次に33ng (3μL)を20μLのddPCR反応当たり分析した。
CCL3L1について、各精製ヒトゲノムDNA試料(Coriell)815ngをMseI (NEB)7.5単位で10μL中で37℃で1時間消化した。
消化物をTE緩衝液で3.5倍から35μLに希釈し、その後69ng (3μL)を20μL ddPCR反応当たりアッセイした。
MRGPRX1アッセイ配列(36)は(フォワードプライマー)5′‐TTAAGCTTCATCAGTATCCCCCA‐3′、(リバースプライマー)5′‐CAAAGTAGGAAAACATCATCACAGGA‐3′、及び(プローブ)6FAM‐ACCATCTCTAAAATCCT‐MGBNFQであった。
染色体Xアッセイ配列(37)は(フォワードプライマー)5′‐GATGAGGAAGGCAATGATCC‐3′、(リバースプライマー)5′‐TTGGCTTTTACCAAATAGGG‐3′、及び(プローブ)5′‐FAM‐TGTTTCTCTCTGCCTGCACTGG‐BHQ1‐3′(統合DNA技術)であった。
CYPD2D6(Hs00010001_cn)は、プライマーとFAM‐MGBNFQプローブ(Applied Biosystems)の20×予混合として購入された。
改変CCL3L1アッセイ配列(19)は、(フォワードプライマー)5′‐GGGTCCAGAAATACGTCAGT‐3′、(リバースプライマー)5′‐CATGTTCCCAAGGCTCAG‐3′、及び(プローブ)6FAM‐TTCGAGGCCCAGCGACCTCA‐MGBNFQであった。
全てのCNVアッセイを、RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5′‐GATTTGGACCTGCGAGCG‐3′、(リバースプライマー)5′‐GCGGCTGTCTCCACAAGT‐3′、及び(プローブ)VIC‐CTGACCTGAAGGCT‐MGBNFQでデュプレックスした。
熱サイクリング条件は、95℃×10分(1サイクル)、94℃×30秒と60℃×60秒(40サイクル)、98℃×10分(1サイクル)、12℃保持とした。
GRB7およびERBB2コピー数の変化の測定
各正常および腫瘍性乳房組織サンプル(D8235086-1、Biochain)の精製DNA (20ng)を、37℃で10μL中のNlaIII0.2単位で1時間消化した。
制限DNAを、ddPCR反応20μL当たり8.8ng (4.4μL)でddPCR Mastermixに直接添加した。
ERBB2(Hs02803918_cn)およびGRB7(Hs02139994_cn)アッセイは、プライマーおよびFAM‐MGBNFQプローブ(Applied Biosystems)の20×予混合物として購入し、上述のRPP30参照アッセイで二重化した。
熱サイクリング条件は、95℃×10分(1サイクル)、94℃×30秒と60℃×60秒(40サイクル)、98℃×10分(1サイクル)、12℃保持とした。
まれな対立遺伝子検出
HT‐29のセルライン(ATCC)からのBRAF V600Eの変量DNA (HTB‐38D)の希薄化シリーズを、ワイルドタイプDNA (NA19205, Coriell)の高一定背景(5000部/μL)で調製した。
ddPCRについては、無傷のヒトゲノムDNAの濃度が>66ng/20μLの反応である場合、粘度の付随する増加は、平均液滴容積を変化させることができ、その結果、DNA定量の精度に影響を及ぼす可能性がある。
したがって、この性質のサンプルに対しては、DNAを断片化し、溶液粘度を低下させるために制限酵素消化が推奨される。
我々の経験では、いったん断片化されると、ヒトゲノムDNA濃度は、平均液滴容積に影響を及ぼすことなく、1μg/20μLの反応を超えることができる。
したがって、ddPCRに先立ち、希釈系列の各試料を、1× NEB緩衝液4およびBSAを含む100μL中の40 UのHaeIII (NEB)で消化した。
BRAF V600E/野生型duplex TaqManアッセイは、一般的なプライマー(フォワード)5′-CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA-3′、(リバース)5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3’、および特異的プローブ(BRAF V600E)6FAM-TAGCTACAGAGAAATC-MGBNFQおよび(野生型) VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-MGBNFQを用いた。
希釈系列の各試料には8個のddPCRウェルを用いた。
熱サイクリング条件は、95℃×10分(1サイクル)、94℃×30秒および62.7℃×60秒(55サイクル)、12℃保持とした。
母体血漿中の無細胞胎児および全DNAの定量
全血(3×10mL)を、妊娠10~20週齢の健康な妊娠ドナーから、製造者の指示に従って、無細胞DNA BCTチューブ(Streck)に静脈穿刺して採取した(ProMedDx)。
胎児の性別は、検体採取から6週間以内に超音波検査により判定した。
試験管は室温で48時間まで保存した後、Bio-Radに4℃で一晩輸送し、受領後処理した。
全血を1600gで10分間遠心し、上級者は除去して新しい管に移し、16000gで10分間遠心し、上級者は除去して新しい管に移し、その後、無細胞プラズマを-80℃で貯留した。
無細胞血漿(5mL)を解凍し、manufactuerʼsプロトコールに従ってQIAmp循環核酸キット(Qiagen)を用いて無細胞DNAを単離し、AVE緩衝液(150μL)に溶出した。
溶出液の一部(99μL)に、1× NEB緩衝液4中のHhaI (30 U)、HpaII (60 U)及びBstUI (30 U)を含む単管消化物を、総容量120μL中で与えた。
溶出液の第2の部分(33μL)を、制限酵素を水に置換した非消化対照混合物中で使用した。
混合物を37℃で2時間、60℃で2時間、次いで65℃で20分間インキュベートした。
制限酵素消化混合物を分割し、SRY/TERT、RASSF1/RNaseP、およびRASSF1/β-アクチンの3つのddPCRデュプレックスアッセイに供した。
制限酵素混合物は、非メチル化RASSF1およびβ-アクチンTaqMan鋳型を切断するが、SRY、RNaseP、またはTERTは切断しない。
非消化対照混合物を分割し、RASSF1/RNasePおよびRASSF1/β-アクチンの2つのddPCRデュプレックスアッセイに供した。
β-アクチンは胎児と母体のDNAの両方で低メチル化され、酵素カクテルによって完全に消化される。
RASSF1(34)およびSRY(37)アッセイが以前に報告されている。
RNasePおよびTERTコピー数参照アッセイを商業的に購入した(Applied Biosystems)。
β‐アクチンアッセイは、Chanら(フォワードプライマー)5′GCAAAGGCGAGGCTCTGT‐3′、(リバースプライマー)5′‐CGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGG‐3′、及び(プローブ)VIC‐ACCGCCGAGACCGCGTC‐MGBNFQから改変した。
RASSF1/RNasePとRASSF1/β‐アクチン二本鎖について、1× GCリッチ溶液(Roche)を集合ddPCR反応混合物の成分として用いた。
熱サイクリング条件は95℃×10分(1サイクル)、95℃×30秒と60℃×60秒(45サイクル)、4℃保持とした。
各サンプルについて、総DNA濃度(G.E/mL)の6つの独立したアッセイ測定を、1つのTERT、1つのβ‐アクチン、2つのRASSF1、および2つのRNasePアッセイから行った。
各アッセイ測定は、7つの複製ddPCRウェルからのデータを含んだ。
全7反復ウェルからの液滴数(陽性および陰性)を組み合わせて、単一の「メタウェル」を得た。
6つの測定メタウェルの各々の濃度と信頼区間を計算した。(4)
適切な希釈係数を適用して全無細胞DNA濃度(G.E./mL)を求め、それに応じて信頼区間をスケールした。
6つの総測定値の重み付け平均を計算した。重みはこれらの測定値の信頼区間分散の逆数である。
消化されたRASSF1については、2つの独立したアッセイ測定があり、これらも同様に組み合わせられる。
SRYについては、直接使用した測定が1つあり、半数性を説明するために係数2によるスケーリングが行われている。
その後、胎児負荷量を関連するポアソン95%信頼区間との比として算出する。

この記事の著者:仲田洋美医師
医籍登録番号 第371210号
日本内科学会 総合内科専門医 第7900号
日本臨床腫瘍学会 がん薬物療法専門医 第1000001号
臨床遺伝専門医制度委員会認定 臨床遺伝専門医 第755号