目次
📍 クイックナビゲーション
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）や遺伝子検査の説明で必ず出てくる「アニーリング」という言葉。英語の annealing はもともと金属の「焼きなまし」を指しますが、分子生物学では、熱で一本鎖にほどいたDNAやRNAが、冷やされることで相補的な相手と再び結合し、二本鎖に戻ることを意味します。PCRでは、この仕組みを使ってプライマーを狙った位置に結合させる工程をアニーリングと呼びます。この記事では、アニーリングの定義と仕組み、PCRでの役割、温度の決め方とTm値（融解温度）との関係、温度が適切でない場合の影響を、原著論文にもとづいて臨床遺伝専門医が解説します。
Q. アニーリングとは何ですか？まず結論だけ知りたいです
A. アニーリング（annealing）とは、熱などで一本鎖に分かれた相補的なDNAやRNAが、冷却によって塩基対を組み直し、二本鎖に戻ることです。PCRでは、反応液の温度を下げて、プライマーと呼ばれる短い一本鎖DNAを鋳型DNAの相補的な配列に結合させる工程を指します。アニーリング温度はプライマーのTm値（融解温度）を基準に決め、低すぎると余計な場所に結合し、高すぎると結合しにくくなります。
- ➤定義 → 一本鎖の相補的な核酸が冷却によって二本鎖に戻ること。PCRではプライマーが鋳型に結合する工程
- ➤語源 → 金属の「焼きなまし（加熱して徐冷する）」になぞらえた呼び名。量子アニーリングとは別の概念
- ➤目的 → DNAポリメラーゼがDNA合成を始めるための起点をつくる
- ➤温度 → プライマーのTm値より数℃低い温度から始め、結果を見て調整する
- ➤注意点 → 最適温度から外れると、非特異的な増幅や収量低下が起こりうる
🧬 アニーリングの基本情報
| 項目 | 内容 |
|---|---|
| 読み方・英語 | アニーリング（annealing）。アニール（anneal）とも。原義は金属の「焼きなまし」 |
| 定義 | 一本鎖の相補的な核酸（DNA・RNA）が、冷却によって塩基対を形成し、二本鎖に戻ること |
| PCRでの意味 | 変性（一本鎖化）→ アニーリング（プライマーの結合）→ 伸長（DNA合成）の3ステップのうち2番目の工程 |
| 温度の目安 | プライマーのTm値（融解温度）より数℃低い温度から開始。具体値はプライマー・酵素・反応条件によって異なる |
| 関連用語 | ハイブリダイゼーション（同じ現象を指すことが多い）、Tm値（融解温度）、プライマー、変性、伸長 |
※本記事は一般の方と遺伝診療に関わる方の両方に向けた用語解説です。特定の検査を勧めるものではありません。
1. アニーリングとは
PCRにおけるアニーリングとは、熱変性によって一本鎖になったDNAに対して、プライマーと呼ばれる短いDNA分子が結合する工程のことです。このプロセスは、PCR（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）の3つの基本ステップのうちの1つであり、変性（denaturation）、アニーリング（annealing）、伸長（extension）の順に行われます[6]。
アニーリングの段階では、反応液の温度を下げることで、プライマーが一本鎖DNAの相補的な配列に特異的に結合します。このプライマーは、DNAポリメラーゼが新しいDNA鎖を合成するための開始点となります。アニーリングの後に伸長反応が行われ、DNAポリメラーゼがプライマーを起点として新しいDNA鎖を合成します。これらのステップを繰り返すことで、目的のDNA領域が指数関数的に増幅されます。
一言でいうと
アニーリングをもっとも広い意味で一言にまとめると、「ほどけた相補的な核酸の鎖どうしが、冷やされて再びペアを組むこと」です。DNAどうし、DNAとRNA、RNAどうしのいずれでも起こります。PCRではこの一般的な現象のうち、「プライマーが鋳型DNAに結合する場面」を特に指してアニーリングと呼んでいる、と整理すると混乱しません。
DNA・RNAでアニーリングが起こる仕組み
DNAはふつう、2本の鎖が向かい合って二重らせんをつくっています。2本の鎖をつないでいるのは、塩基どうしの水素結合です。アデニン（A）はチミン（T）と、グアニン（G）はシトシン（C）と決まった相手とだけ対をつくります。この相補的な塩基配列のルールが、アニーリングの土台です。RNAではチミンの代わりにウラシル（U）が使われ、AはUと対をつくります。
二本鎖DNAを加熱すると、水素結合が切れて2本の鎖が離れ、一本鎖になります。これを変性（denaturation）と呼びます。その後に温度を下げると、一本鎖どうしが互いに相補的な相手を見つけ、再び塩基対を組んで二本鎖に戻ります。これがアニーリングです。加熱で分かれたDNA鎖が、冷却によって相補鎖どうしで特異的に再結合することは、1960年にDotyやMarmurらが物理化学的・生物学的な実験で示しました[1][2]。
重要なのは、アニーリングが配列に依存して起こるという点です。相補的な配列が長く一致しているほど二本鎖は安定し、一致しない塩基（ミスマッチ）が含まれるほど不安定になります。1979年のWallaceらの研究では、短い合成オリゴヌクレオチドと標的DNAの間に1塩基のミスマッチがあると、二本鎖の熱安定性が下がることが示されました[8]。PCRや遺伝子検査がねらった配列だけを見分けられるのは、この「わずかな違いで結合の安定性が変わる」性質を温度で使い分けているからです。
💡 用語解説：変性とアニーリングは「逆向きの反応」
変性は「熱で二本鎖をほどくこと」、アニーリングは「冷やして二本鎖に戻すこと」です。両者は同じ平衡の逆向きで、どちらに傾くかは主に温度で決まります。二本鎖のちょうど半分がほどける温度をTm値（融解温度）と呼び、アニーリング温度を考えるときの基準になります。
2. アニーリングの語源と、似た用語との違い
アニーリングは、金属を加熱してからゆっくり冷ます「焼きなまし」を意味する英語 annealing に由来する呼び名です。同じ言葉が材料工学や量子計算でも使われますが、分子生物学のアニーリングは「核酸が二本鎖に戻ること」を指し、それらとは別の概念です。
語源は金属の「焼きなまし」
英語の annealing（アニーリング）は、日本語では「焼きなまし」「焼鈍（しょうどん）」と訳される金属加工の用語です。金属を高温にしてからゆっくり冷ますことで、内部のひずみを取り除き、組織を整える操作を指します。核酸の実験でも「いったん加熱して一本鎖にほどき、冷ますことで正しい相手どうしの二本鎖に戻す」という操作を行うため、この言葉が借りられました。
つまり、「加熱してから冷ます」という操作の共通点から生まれた比喩的な呼び名です。「アニーリングの日本語訳は？」という質問に対しては、原義は「焼きなまし」ですが、分子生物学では訳さずに「アニーリング」とカタカナで使うのが一般的です。
量子アニーリング・材料のアニーリングとの違い
「アニーリング」で検索すると、量子コンピュータや金属加工の解説がたくさん出てきます。これらは言葉が同じだけで、対象も目的もまったく異なります。混同しないよう、分野ごとの意味を表にまとめます。
| 分野 | アニーリングの意味 | 対象 |
|---|---|---|
| 分子生物学（この記事） | 一本鎖の相補的な核酸が冷却によって二本鎖に戻ること。PCRではプライマーの結合工程 | DNA・RNA |
| 材料工学 | 加熱後に徐冷して内部のひずみを除き、組織を整える熱処理（焼きなまし） | 金属・ガラス・樹脂など |
| 計算科学 | 焼きなましになぞらえた最適化の計算手法（シミュレーテッドアニーリング、量子アニーリング） | 組合せ最適化問題 |
ハイブリダイゼーションとの違い
アニーリングとハイブリダイゼーションは、どちらも相補的な一本鎖核酸が塩基対を形成して二本鎖になる現象を指し、文脈によって重なって使われます。一般に「アニーリング」は、変性した相補鎖の再会合や、PCRでプライマーが鋳型に結合する段階を表すことが多く、「ハイブリダイゼーション」は、標識したプローブと標的核酸の結合を利用する検出法（サザンブロット、FISHなど）を含む、より広い文脈で使われます。両者を別の現象と考える必要はありません。
3. PCRにおけるアニーリングの役割
PCRにおけるアニーリングの役割は、プライマーを鋳型DNAの狙った位置に結合させ、DNAポリメラーゼがDNA合成を始めるための起点をつくることです。この工程の正確さが、PCRで目的の配列だけを増やせるかを左右します。
PCRの3ステップ（変性・アニーリング・伸長）
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、特定のDNA領域を試験管の中で大量に増やす技術です[3][4]。1サイクルは、温度の異なる3つのステップでできています[6]。
🌡️ PCRの3ステップと温度の目安
| ステップ | 何が起こるか | 温度の目安 |
|---|---|---|
| ① 変性 | 二本鎖DNAの水素結合が切れて一本鎖になる | おおむね94〜98℃（一例として94℃） |
| ② アニーリング | プライマーが鋳型DNAの相補的な配列に結合する | プライマーのTm値より数℃低い温度（一例として52〜58℃） |
| ③ 伸長 | DNAポリメラーゼがプライマーを起点にDNA鎖を合成する | Taq DNAポリメラーゼでは70〜80℃が至適（一般に72℃前後） |
※温度はあくまで目安です。使用するDNAポリメラーゼ・試薬・プライマーによって推奨条件は異なります。表の具体値はLorenz（2012）の標準的なプロトコルの一例にもとづきます[7]。
このサイクルを繰り返すと、1回ごとに目的の領域が理論上2倍に増えていきます。耐熱性のDNAポリメラーゼ（Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ）が導入されたことで、高い温度で反応を行えるようになり、増幅の特異性・収量・感度が大きく向上しました[5]。アニーリングを高めの温度で行えることが、狙った配列だけを増やすうえで決定的に重要だったのです。
アニーリングは何のためにするのか
アニーリングは、DNAポリメラーゼが合成を始めるための「足場」をつくるために行います。DNAポリメラーゼは、何もないところから新しいDNA鎖を作り始めることができません。すでに鋳型と対をつくっている短い鎖の3′末端から、ヌクレオチドを1つずつつなげます。そのため、合成を始めたい場所に、あらかじめ短い鎖（プライマー）を結合させておく必要があります。
もう1つの目的は、増やす範囲を決めることです。PCRでは、増やしたい領域の両端にそれぞれ結合する2本のプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）を使います。2本のプライマーが挟んだ区間が増幅対象となるため、どこに結合するかが何を増やすかを決めます。
PCRでは、2本のプライマーが鋳型DNAの相補的な配列に結合します。DNA合成は各プライマーの3′末端から始まり、増幅対象領域へ向かって進みます。
プライマーとは
プライマーとは、増やしたい領域の端に相補的な配列をもつ、短い一本鎖の合成DNAです。化学的にはオリゴヌクレオチドの一種で、PCRで使うプライマーの多くは20塩基前後の長さです。
プライマーの配列は、増やしたいDNAの塩基配列をもとに設計します。プライマーがゲノムの別の場所にも似た配列をもっていると、そこにも結合してしまい、目的外の産物（非特異的な増幅産物）ができる原因になります。また、プライマーどうしが結合してしまう「プライマーダイマー」も、余計な産物の原因として知られています。こうした問題を減らすために、プライマーの設計段階で配列の特異性や2本のTm値のバランスを確認し、アニーリング温度の調整で最終的な特異性を確保します。
4. アニーリング温度の決め方とTm値との関係
アニーリング温度は、プライマーのTm値（融解温度）より数℃低い温度から始めて、実際の結果を見ながら調整して決めます。Tm値は計算で予測できますが、あくまで予測値であり、最終的な最適温度は実験で確かめる必要があります。
アニーリング温度は何度？（目安）
よく聞かれる「PCRのアニーリング温度は何度ですか？」という質問に対して、すべての反応に共通する1つの正解はありません。標準的なプロトコルの一例では、プライマーの見かけのTm値より約5℃低い温度で30秒間アニーリングを行い、温度としては52〜58℃程度が理想的とされています[7]。一般的なPCRでは、おおむね50〜60℃台に設定されることが多いものの、プライマーの長さや配列、使うDNAポリメラーゼによって最適な温度は変わります。
⚠️ 注意：「何℃が正解」とは言えません
アニーリング温度の最適値は、プライマーの配列、反応液の塩濃度（特にマグネシウムイオン濃度）、使う酵素、鋳型DNAの性質によって変わります。他の実験条件をそのまま流用しても、同じ結果になるとは限りません。試薬メーカーの推奨条件を出発点にして、結果を見て調整するのが基本です。
Tm値（融解温度）とは
Tm値（融解温度）とは、二本鎖の核酸のちょうど半分が一本鎖にほどける温度です。Tmは melting temperature の略で、「融解温度」と訳されます。Tm値より高い温度では二本鎖はほどけやすく、低い温度では結合しやすくなります。
Tm値とアニーリング温度の関係は、次のように整理できます。アニーリング温度をTm値より少し低く設定すると、プライマーは鋳型の相補的な配列に十分な割合で結合します。一方で、Tm値から大きく下げすぎると、完全には一致しない配列にも結合できるようになってしまいます。つまりアニーリング温度は、「結合のしやすさ」と「結合相手の選り好み（特異性）」のバランスを取る温度として、Tm値を基準に決めるのです。
なお、Rychlikらは、プライマーのTm値だけでなく増幅産物（PCR産物）のTm値も考慮した最適アニーリング温度の計算方法を提案しています。最適アニーリング温度（Ta opt）＝ 0.3 ×（不安定な方のプライマーと鋳型の組のTm値）＋ 0.7 ×（PCR産物のTm値）− 14.9 という式です[6]。この研究は、最適温度の見極めが特に重要になるのは、長い産物を増やす場合や、ゲノムDNA全体を鋳型にする場合だと述べています[6]。
決め方の3ステップ
実際のアニーリング温度は、次の3つのステップで決めていくのが一般的です。
🧪 アニーリング温度を決める3ステップ
| ステップ | やること | ポイント |
|---|---|---|
| ① Tm値を求める | 2本のプライマーそれぞれのTm値を計算する | 計算値は予測値。最近接塩基対法の計算ツールが推奨される |
| ② 出発温度を決める | Tm値より数℃（おおむね3〜5℃）低い温度から始める | 2本のTm値が違う場合は、低い方（不安定な方）を基準にする |
| ③ 結果を見て調整する | 増幅産物を電気泳動などで確認し、温度を上げ下げする | 余計な産物が出れば上げ、目的産物が増えなければ下げる |
2本のプライマーのTm値が大きく離れていると、どちらか一方に合わせた温度では、もう一方がうまく働きません。そのため、プライマー設計の段階で、2本のTm値をできるだけ近づけておくことが大切です。
Tm値の計算式
Tm値にはいくつかの計算方法があります。もっとも簡単なのは、塩基の数だけから概算する方法です。
💡 簡易式（いわゆるWallace則）
Tm ≒ 2 ×（AとTの数）＋ 4 ×（GとCの数）［℃］
たとえば、AとTが10個、GとCが10個の20塩基のプライマーなら、2×10＋4×10＝60℃と概算できます。GC含量による安定性の違いを簡略化した式ですが、実際のTm値には隣接する塩基対の組み合わせや塩濃度なども影響します。
この簡易式は一般に「Wallace則」と呼ばれています。ただし、あくまで短いオリゴヌクレオチドを特定の塩濃度で使う場合の概算であり、長いプライマーや塩濃度が異なる条件では誤差が大きくなります。
より正確な方法として現在標準的に使われているのが、最近接塩基対法（nearest-neighbor法）です。隣り合う塩基対の組み合わせごとに安定性が異なることを考慮して計算する方法で、SantaLuciaが1998年に統一的なパラメータをまとめています[9]。多くのプライマー設計ソフトやTm計算ツールはこの考え方を採用しています。ツールによって塩濃度などの前提が異なるため、同じプライマーでも計算値が数℃ずれることがあります。
Tm値を左右する要因（長さ・GC含量・塩濃度）
Tm値、つまり二本鎖の安定性は、主に次の要因で変わります。
📊 Tm値を左右する主な要因
GとCの割合が高い領域（GCリッチな領域）は、二本鎖が強く結びついているため、変性させにくく、プライマーの結合も不安定になりやすい難しい鋳型です。GC含量が60％を超えるような鋳型では、DMSOを加えて塩基対の形成を弱め、実質的にTm値を下げる工夫が紹介されています[7]。また、数kbを超える長い断片を増やすLong range PCRでは、Tm値の高いプライマーを設計し、アニーリング条件を慎重に最適化することが求められます。
5. アニーリング温度が高すぎる・低すぎるとどうなる？
アニーリング温度が低すぎると目的外の結合が増え、高すぎるとプライマーが結合しにくくなって収量が落ちます。Rychlikらは、最適温度より低くても高くても、非特異的な産物ができ、収量が下がりうると報告しています[6]。
高すぎる・低すぎる場合の比較
🌡️ アニーリング温度と結果の関係
| アニーリング温度 | プライマーの結合 | 特異性・収量 | 電気泳動での典型的な見え方 |
|---|---|---|---|
| 低すぎる | ミスマッチを含む配列や、部分的に似た配列にも結合してしまう | 非特異的な産物が増え、目的産物が減る | 長さの違う余計なバンドが複数出る、スメア（にじみ）が出る |
| 適切 | 目的の配列に十分な割合で結合する | 目的産物が効率よく特異的に増える | 目的の長さに1本のはっきりしたバンドが出る |
| 高すぎる | 結合する確率そのものが下がる | 反応効率が下がり、収量が落ちる | 目的のバンドが薄い、または出ない |
※電気泳動の見え方は典型例です。余計なバンドや収量低下は、マグネシウムイオン濃度、鋳型DNAの量や質、プライマー設計など、温度以外の要因でも起こります。
温度が低すぎる場合に何が起きているかというと、プライマー内部の1塩基のミスマッチや部分的な結合まで許容されてしまうため、プライマーが本来の標的以外の配列にもアニーリングしてしまうのです[6]。一方、温度が高すぎる場合は、プライマーが鋳型に結合している時間の割合そのものが小さくなり、合成の起点が減ってしまいます。反応条件が緩すぎると長さの異なる多数の余計な産物ができ、厳しすぎると産物ができない、という関係は、PCRの最適化の基本として整理されています[7]。
⚠️ よくある誤解：「温度を上げるほど特異性が上がる」は一方向ではない
「アニーリング温度を上げれば特異性が上がる」と説明されることがありますが、これは最適温度より低い側での話です。最適温度を超えて上げすぎると、今度は収量が落ち、条件によっては非特異的な産物が生じることもあります[6]。大切なのは「最適温度を探すこと」であり、温度は高ければよいわけではありません。
温度を調整するときの考え方
アニーリング温度の調整は、結果を見ながら方向を決めます。余計なバンドやスメアが出るときは温度を上げ、目的のバンドが薄い・出ないときは温度を下げる、というのが基本的な考え方です。
ただし、PCRの特異性を左右するのは温度だけではありません。PCRの問題の多くは、マグネシウムイオン濃度の調整とアニーリング温度の操作で解決できるとされています[7]。そのうえで、特異性を高めるための工夫として、次のような方法も知られています。
タッチダウンPCRは、最初のサイクルを高めのアニーリング温度で始め、サイクルごとに少しずつ温度を下げていく方法です。最初に特異的な産物を優先して増やしておくことで、後半に温度を下げても、すでに増えた目的産物が優位を保ちます[10]。ホットスタートPCRは、反応開始前の低い温度でプライマーが誤って結合したり、プライマーどうしが結合したりするのを防ぐ方法で、微量な鋳型の増幅で特に有用とされています[11]。
アニーリング時間の目安
アニーリングの時間は、標準的なプロトコルでは30秒が一例として示されています[7]。プライマーは反応液中に鋳型より大過剰に存在するため、結合自体は短時間で進みます。一方、DNAポリメラーゼの種類によっては、より短いアニーリング時間を推奨するものもあります。アニーリング時間を長くしすぎると、非特異的な結合の機会が増える場合もあるため、使用する酵素の推奨条件に従うのが基本です。
6. PCR以外のアニーリング（オリゴDNAのアニーリング）
アニーリングはPCR専用の操作ではなく、相補的な2本の合成オリゴヌクレオチドを二本鎖にするときにも使われます。分子生物学の実験では、短い二本鎖DNAを作りたいときに、相補的な配列をもつ2本の一本鎖オリゴヌクレオチドを混ぜて加熱し、冷却することで二本鎖を形成させます。
この操作の原理は、PCRのアニーリングと同じです。加熱によって、オリゴヌクレオチドが自分自身の中で作っている部分的な二本鎖（二次構造）や、誤った相手との結合をいったんすべてほどきます。その後に冷却すると、正しい相補的な相手どうしが塩基対を組みます。二本鎖を組んだオリゴDNAは、クローニングの際にベクターへ組み込む短い断片（アダプターやリンカー）などとして利用されます。オリゴヌクレオチドのアニーリングは通常DNAについて説明されますが、同じ原理はRNAにも用いられます。
2本のオリゴヌクレオチドどうしをアニーリングさせる場合は、加熱後に温度をゆっくり下げることで、正しい相手どうしの二本鎖が形成されやすくなります。
💡 用語解説：「ゆっくり冷ます」はPCRには当てはまらない
オリゴDNAどうしのアニーリングでは徐冷が有効ですが、PCRのアニーリングでは、反応液の温度を短時間でアニーリング温度まで下げて行います。PCRではプライマーが鋳型より大過剰に存在するため、急速に温度を下げても結合が十分に進むからです。「アニーリングは必ずゆっくり冷ます操作」と一般化しないよう注意してください。
7. 遺伝子検査とアニーリングのつながり
PCRを使う遺伝子検査の多くは、「プライマーが正しい位置にだけ結合する」という特異的なアニーリングを前提にしています。アニーリングは研究室の実験手技であると同時に、臨床の遺伝子検査の精度を支える基礎でもあります。
たとえば、1回の反応で複数の領域を同時に増やすマルチプレックスPCRでは、何組ものプライマーが同じアニーリング温度で働かなければなりません。そのため、すべてのプライマーのTm値をそろえ、プライマーどうしが結合しないように設計することが特に重要になります。増幅の過程を蛍光でリアルタイムに測定するリアルタイムPCR（qPCR）や、反応液を微小な区画に分けて1分子ずつ数えるデジタルPCR（ddPCR）でも、特異的なアニーリングが測定値の信頼性の前提になります。
出生前診断の分野では、羊水検査などで染色体の数の変化を短時間で調べる迅速検査にQF-PCRが用いられます。また、臨界変性温度を調整して、少数派の変異をもつDNAを選択的に濃縮するCOLD-PCRのように、PCR産物の臨界変性温度を利用して、変異を含むDNAを優先的に増幅する方法もあります。
臨床的に見落とされやすい点として、プライマーが結合する位置そのものに個人のバリアント（塩基の違い）がある場合があります。前述のとおり、1塩基のミスマッチでも二本鎖の安定性は大きく下がります[8]。そのため、プライマーの結合部位にバリアントがあると、その側のアレル（対立遺伝子）のアニーリングが弱まり、増幅されにくくなることがあります。
🩺 院長コラム【「数℃の違い」が検査の信頼性を左右する】
アニーリングは、教科書では「プライマーが結合する工程」と一行で説明されることが多い用語です。しかし遺伝医学の視点から見ると、この工程は検査の特異性、つまり「狙った配列だけを正しく調べられているか」を決める要の部分です。わずか1塩基の違いで二本鎖の安定性が変わるという性質は、PCRで変異を見分けられる理由であると同時に、プライマーの結合部位にバリアントがあると増幅がうまくいかなくなりうる理由でもあります。
遺伝子検査の結果を解釈するときに重要なのは、「どの方法で、どの範囲を調べた結果なのか」を確認することです。結果の数値や判定だけでなく、その背後にある原理と限界を理解しておくことが、検査結果を正しく受け止めるための基礎になります。
🏥 遺伝子検査の仕組みや結果の意味を知りたい方へ
遺伝子検査で何がわかり、何がわからないのかを理解したうえで検査を選びたい方は、
臨床遺伝専門医が運営するミネルバクリニックの情報ページをご活用ください。
よくある質問（FAQ）
Q1. アニーリングとはどういう意味ですか？日本語では何といいますか？
アニーリング（annealing）とは、分子生物学では、熱などで一本鎖に分かれた相補的なDNAやRNAが、冷却によって塩基対を組み直し、二本鎖に戻ることを指します。PCRでは、プライマーが鋳型DNAに結合する工程を意味します。英語の原義は金属の「焼きなまし（焼鈍）」で、「加熱してから冷ます」という操作が似ていることから、この言葉が使われるようになりました。分子生物学では訳さずに「アニーリング」とカタカナで使うのが一般的です。
Q2. PCRのアニーリング温度は何度ですか？
すべての反応に共通する1つの正解はありません。一般には、プライマーのTm値（融解温度）より数℃（おおむね3〜5℃）低い温度から始めます。標準的なプロトコルの一例では、Tm値より約5℃低い温度で30秒間行い、52〜58℃程度が理想的とされています。実際の最適温度は、プライマーの配列、塩濃度、使うDNAポリメラーゼによって変わるため、試薬の推奨条件を出発点にして、結果を見て調整します。
Q3. Tm値とアニーリング温度はどう関係しますか？
Tm値は、二本鎖の核酸のちょうど半分が一本鎖にほどける温度です。アニーリング温度はこのTm値を基準に、少し低い温度に設定します。Tm値より少し低いと、プライマーが目的の配列に十分な割合で結合します。下げすぎると、完全には一致しない配列にも結合しやすくなります。2本のプライマーのTm値が異なる場合は、低い方を基準にするのが一般的です。
Q4. アニーリング温度が高すぎる・低すぎるとどうなりますか？
低すぎると、プライマーがミスマッチを含む配列や部分的に似た配列にも結合し、目的以外の産物（非特異的な増幅産物）が増えて、目的の産物が減ります。高すぎると、プライマーが結合しにくくなり、反応効率が下がって収量が落ちたり、産物が得られなくなったりします。最適温度より高くても低くても非特異的な産物が生じうるとの報告があり、温度は高ければよいわけではありません。
Q5. アニーリング温度の計算式はありますか？
アニーリング温度の基準となるTm値は計算で予測できます。簡易的には、Tm＝2×（AとTの数）＋4×（GとCの数）［℃］という式（いわゆるWallace則）で概算できますが、短いオリゴヌクレオチド向けの目安です。現在は、隣り合う塩基対の安定性を考慮する最近接塩基対法による計算ツールが標準的に使われています。産物のTm値も考慮した最適アニーリング温度の計算式も提案されていますが、いずれも予測値であり、最終的には実験で確認します。
Q6. アニーリングとハイブリダイゼーションの違いは何ですか？
どちらも相補的な一本鎖核酸が塩基対を形成して二本鎖になる現象を指し、文脈によって重なって使われます。一般に「アニーリング」は、変性した相補鎖の再会合やPCRでプライマーが鋳型に結合する段階を表すことが多く、「ハイブリダイゼーション」は、プローブと標的核酸の結合を利用する検出法を含む、より広い文脈でも使われます。両者を別の現象と考える必要はありません。
Q7. アニーリングの時間はどれくらいですか？
標準的なプロトコルでは30秒が一例として示されています。プライマーは鋳型より大過剰に存在するため、結合自体は短時間で進みます。DNAポリメラーゼの種類によってはより短い時間を推奨するものもあり、長くしすぎると非特異的な結合の機会が増える場合もあります。使用する酵素の推奨条件に従うのが基本です。
まとめ
アニーリングとは、一本鎖に分かれた相補的なDNAやRNAが、冷却によって塩基対を組み直し、二本鎖に戻ることです。PCRでは、プライマーを鋳型DNAの狙った位置に結合させ、DNAポリメラーゼが合成を始める起点をつくる工程を指します。名前は金属の「焼きなまし」に由来しますが、量子アニーリングや材料の熱処理とは別の概念で、ハイブリダイゼーションとは現象としてほぼ同じものを指します。
アニーリング温度は、プライマーのTm値（融解温度）より数℃低い温度から始め、結果を見て調整して決めます。Tm値は長さ・GC含量・塩濃度で変わり、計算値は予測値にすぎません。温度が低すぎると非特異的な産物が増え、高すぎると収量が落ちるため、「最適温度を探すこと」が重要です。
参考文献
- [1] Doty P, Marmur J, Eigner J, Schildkraut C. Strand separation and specific recombination in deoxyribonucleic acids: physical chemical studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 1960;46(4):461-476. [PubMed 16590628]
- [2] Marmur J, Lane D. Strand separation and specific recombination in deoxyribonucleic acids: biological studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 1960;46(4):453-461. [PubMed 16590627]
- [3] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985;230(4732):1350-1354. [PubMed 2999980]
- [4] Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-350. [PubMed 3431465]
- [5] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487-491. [PubMed 2448875]
- [6] Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 1990;18(21):6409-6412. [PubMed 2243783]
- [7] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012;(63):e3998. [PubMed 22664923]
- [8] Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557. [PubMed 158748]
- [9] SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465. [DOI]
- [10] Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. ‘Touchdown’ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991;19(14):4008. [DOI]
- [11] Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Res. 1992;20(7):1717-1723. [DOI]
