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02/06

2021年2月10日(予定)NHKクローズアップ現代でNIPTに関して放送されます。
当院も取材を受けておりますので是非ご覧下さい。

07/02

週間新潮掲載の記事がヤフーニュースに掲載されました。
2か月ほどで消えるのでスクショを張り付けておきます。
news.yahoo.co.jp/articles/a87aec43a59f8b0c15009b6f64bdf48de9559e27

yahooニュース「新型出生前診断」の拡大で”ビジネス化”加速の懸念 儲けに走るクリニックの手口

07/02

www.dailyshincho.jp/article/2020/07020559/?all=1&page=1

新型出生前診断」の拡大で“ビジネス化”加速の懸念 儲けに走るクリニックの手口

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CFTR遺伝子

CFTR遺伝子に関する説明です。この遺伝子の病的変異は常染色体劣性で嚢胞性線維症を引き起こします。全身の外分泌機能に異常をきたし消化管や気道の分泌液が粘稠となり、膵外分泌異常による脂肪吸収不全、栄養障害が起こります。気道分泌の異常は排痰困難・難治性気道感染の原因となり、慢性呼吸不全に至ります。
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遺伝子名CFTR
遺伝子座MIM番号602421
遺伝子座7q31.2
遺伝形式常染色体劣性
疾患名嚢胞性線維症
疾患頻度40人の患者さんが把握されている。日本では、出生約60万人に1人という稀な病気である。
症状全身の外分泌機能に異常をきたし消化管や気道の分泌液が粘稠となり、膵外分泌異常による脂肪吸収不全、栄養障害が起こる。気道分泌の異常は排痰困難・難治性気道感染の原因となり、慢性呼吸不全に至る。(1)出生時もしくは数日以内に発症する腹部膨満(50%以上)または胎便性イレウス(約15%)、(2)乳幼児期、特に離乳期より進行する大量、頻回、悪臭を伴う脂肪便(膵外分泌不全)、(3)発育障害(身長は正常範囲であるが、体重が増えない)、(4)呼吸器の感染症(生後1年以内に約50%が発症し、重症の感染にもかかわらず痰の喀出困難)、が古典的症状とされる。その他、非定型的症状として、慢性膵炎、びまん性汎細気管支炎、先天性両側精管欠損症が知られている。
表現型MIM番号219700

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OMIM 602421
遺伝子名:CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR; CFTR
別名:ATP-BINDING CASSETTE, SUBFAMILY C, MEMBER 7; ABCC7
遺伝子座:7q31.2
疾患との関係
{Bronchiectasis with or without elevated sweat chloride 1, modifier of} 211400 AD
{Hypertrypsinemia, neonatal}
{Pancreatitis, hereditary} 167800 AD
Congenital bilateral absence of vas deferens 277180 AR
Cystic fibrosis 219700 AR
Sweat chloride elevation without CF

CFTR遺伝子の機能

CFTR遺伝子は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターをコードしており、ヌクレオチド結合ドメイン(NBD)でのATPの結合と加水分解のサイクルによってゲートされる低コンダクタンスのCl(-)選択チャネルとして機能し、レギュラトリードメインと呼ばれる複数のコンセンサスリン酸化部位で区別される本質的に不規則なタンパク質セグメントによってしっかりと制御されている。

CFTRは、Clイオンチャネルとしての機能に加えて、他の輸送経路の制御も行っている。例えば、CF患者やホモ接合のCFTR欠損マウスでは、ナトリウムイオンの吸収が亢進しており、野生型のCFTRを添加することで、このナトリウムイオンの吸収亢進は修正される。CFTRと外向き整流塩化物チャネル(ORCC)は異なるチャネルであるが、未知の制御機構を介して機能的につながっている。Schwiebertら(1995)は、正常細胞、CF、野生型または変異型CFTRを導入したCF気道培養上皮細胞を用いて、全細胞および単一チャンネルのパッチクランプ記録、短絡電流記録、ATP放出アッセイを行った結果、CFTRが強力なアゴニストであるATPの細胞外への輸送をトリガーすることによってORCCを制御していることを示した。この結果から、CFTRは、Clイオン自体の伝導に加えて、他の塩化物イオン分泌経路の制御にも機能していることが示唆された。

CFTRタンパク質には、異常な膜タンパク質や分泌タンパク質を速やかに分解する品質管理システムが厳密に適用されており、野生型前駆体の約75%、delF508変異体(602421.0001)の100%が小胞体から出る前に速やかに分解される。Jensenら(1995)は、CFTRおよびおそらく他の固有の膜タンパク質が、小胞体内で成熟する際にプロテアソーム分解の基質となることを示した。Changら(1999)は、輸出不適格のCFTRタンパク質が複数のアルギニンで縁取られたトリペプチド配列を持つことを示した。これらのモチーフのうち、R29、R516、R555、R766の位置のアルギニン残基をリジン残基に置き換えることで4つのモチーフを不活性化すると、同時に変異delF508 CFTRタンパク質が小胞体の品質管理から逃れ、細胞表面で機能するようになった。Changら(1999)は、これらのシグナルの認識を妨害することが、CFの管理に役立つ可能性を示唆した。

Youngerら(2006)は、E3 RMA1(RNF5;602677)、E2 UBC6E(UBE2J1)、derlin-1(DERL1;608813)を含む小胞体膜関連ユビキチンリガーゼ複合体を同定した。この複合体は、細胞質のHSC70(HSPA8;600816)/CHIP(STUB1;607207)E3複合体と協力して、CFTRとdelFl508をトリアージしていた。Derlin-1はCFTRを小胞体膜に保持し、RMA1やUBC6Eと相互作用してCFTRのプロテアソーム分解を促進した。RMA1は翻訳と同時にdelF508のフォールディングの欠損を認識することができたが、CHIPは翻訳後に作用するようであった。RMA1によって検出されたdelF508のフォールディング不全は、CFTRの第2膜スパンニングドメインがN末端ドメインと生産的に相互作用できないことに関係していた。Youngerら(2006)は、RMA1とCHIP E3ユビキチンリガーゼが小胞体膜と細胞質で順次作用し、CFTRとdelF508の折り畳み状態を監視していると結論づけている。

Randakら(1997)は、CFTRのNBF2をマルトース結合タンパク質と融合した可溶性タンパク質として大腸菌で発現させ、ATPの加水分解を触媒してADPとPiを生成することを見出した。ADPの生成物はATPaseの活性を阻害した。また、NBF2はGTPを加水分解してGDPとPiを生成した。しかし、AMPの存在下では、ATPaseの反応はアデニル酸キナーゼの活性に取って代わられ、ATPとAMPから2つのADP分子が形成された。Randakら(1997)は、NBF2に典型的なアデニル酸キナーゼ様のAMP結合部位があることを突き止めた。

CFTRのATPアーゼ活性の構造的基盤を明らかにするために、Ramjeesinghら(1999)は、ウォーカーAコンセンサスモチーフの変異が、精製した無傷のタンパク質によるATP加水分解に及ぼす影響を調べた。どちらかのNBFのウォーカーAモチーフのリジン残基を変異させると、精製した無傷のCFTRタンパク質のATPアーゼ活性が50%以上阻害されたことから、2つのNBFが触媒作用において協同で機能していることが示唆された。驚くべきことに、チャネルのゲーティング速度は、2番目のNBFに変異があった場合にのみ有意に阻害されたことから、ATPアーゼ活性とチャネルのゲーティングは密接に関連していない可能性が示唆された。

RandakとWelsh(2003)は、完全長のCFTRと単離されたヌクレオチド結合ドメイン-2(NBD2)をHeLa細胞で発現させると、ATPase活性とアデニル酸キナーゼ活性を示すことを明らかにした。アデニル酸キナーゼ阻害剤Ap5Aは、CFTRのCl-電流を阻害し、ATP部位とAMP部位に結合してチャネル活性を阻害した。AMPを加えると、NBD2ポリペプチドの酵素活性がATPaseからアデニル酸キナーゼに切り替わった。ATPとAMPは、NBD1とNBD2の二量体化を誘導し、チャネルを開通させるようだ。RandakとWelsh(2003)は、生理的なAMP濃度では、チャネルの活性を制御する主な反応はアデニル酸キナーゼである可能性が高いという仮説を立てた。

JiangとEngelhardt(1998)は、肺におけるCFTRの発現と機能の細胞内での不均一性と、嚢胞性線維症の遺伝子治療への重要な影響についてレビューしている。

嚢胞性線維症は、気道に緑膿菌が持続的に定着し、多形核白血球(PMN)などの炎症細胞がCF患者の気道に移動することが特徴である。PMNは、炎症反応の際に強力な化学運動誘発剤および化学吸引剤であるロイコトリエンBを放出し、その結果、炎症細胞がさらに移動することになる。Cromwellら(1981)は、CF患者の喀痰中にロイコトリエンが存在することを明らかにした。アラキドン酸の酸化代謝物と炎症細胞由来のプロテアーゼは、CFで観察される気道上皮の破壊と脱落に関与していると考えられている。これらの知見に基づき、CFの治療には抗炎症剤が有用であると考えられています。非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であるイブプロフェンは、5-リポキシゲナーゼを阻害し、ロイコトリエンの生成を抑制することから、イブプロフェンがCFの治療に有用であることが示唆されています。イブプロフェンは、明らかな副作用がなく、CFに有効である可能性がKonstanら(1995)によって報告されています。しかし、イブプロフェンの他の作用が、分泌上皮におけるCFTRの発現および/または機能を増加させるように設計された治療戦略を打ち消す可能性がある。Devor and Schultz (1998)は、大腸および気道上皮におけるcAMPを介したCl-分泌に対するイブプロフェンおよびサリチル酸の急性作用を評価し、薬理学的に適切な濃度でこれらの薬物がこれらの上皮における塩化物イオンの分泌を阻害し、この阻害は少なくとも部分的にCFTR Cl-チャネルの遮断によるものであることを発見した。

Weiら(1998)は,予測されたリン酸化部位以外の部位に点変異を持つ成熟したRドメイン変異体のCFTRチャネル活性を調べた。H620Q-CFTRのmRNAを注入したXenopus卵母細胞では、全細胞の塩化物伝導が増加したが、E822KおよびE826K変異体では野生型CFTRに比べて減少した。アニオン透過性とシングルチャネルコンダクタンスは,いずれの変異体も野生型と変わらなかった。COS細胞を用いた単一チャネル研究では,チャネルの開通確率や機能的なチャネルの数が野生型CFTRよりも高い(H260Q)か低い(E822K,E826K)ことが明らかになった。これらの結果から、Rドメインのリン酸化部位以外の部位がゲーティングに影響を与えていることが示唆された。

Chansonら(1999)は,CFTRのdelF508変異を持つヒト膵臓細胞株と,野生型CFTRをトランスフェクションして欠陥を修正した同じ細胞株のギャップジャンクション結合を比較した。細胞内のcAMPを上昇させる薬剤やプロテインキナーゼAを特異的に活性化する薬剤に暴露すると、CFTRを発現させた細胞対では塩化物イオン電流が誘発され、接合部コンダクタンスが著しく増加したが、親細胞ではなかった。このように、機能的なCFTRを発現させることで、CF細胞では塩化物イオンチャネルだけでなく、接合部コンダクタンスのcAMP依存性の制御も回復した。その結果、ギャップジャンクションチャネルの制御不良が、CFに罹患した組織の機能変化に寄与していると考えられる。

Reddyら(1999)は、単離したばかりの正常な汗管において、上皮性ナトリウムチャネル(ENaC; 600228)の活性がCFTRの活性に依存し、それとともに増加することを示しました。Reddyら(1999)は、嚢胞性線維症における塩化物透過性の主な欠陥は、この組織において活性化されないナトリウムコンダクタンスを二次的に伴うことも発見した。したがって、嚢胞性線維症における塩分吸収の低下は、Clイオンコンダクタンスの不良だけでなく、ナトリウムコンダクタンスの不良にも起因する。

Weixel and Bradbury (2000)は、in vivoのクロスリンクおよびin vitroのプルダウンアッセイを用いて、全長のCFTRがエンドサイトーシス・アダプター複合体AP2(601024参照)に結合することを示した。1424位のアラニン残基をチロシンに置換すると、AP2がCFTRのC末端に結合する能力が著しく低下した。しかし、イヌザメのCFTRのこの位置に通常存在するフェニルアラニン残基に変異させても、AP2の結合は阻害されなかった。これらの結果から、CFTRのC末端にはチロシンをベースとした内在化シグナルが存在し、エンドサイトーシス・アダプター複合体であるAP2と相互作用することで、CFTRがクラスリンでコートされた小胞に効率よく侵入することが示唆された。

Wangら(2000)は、親水性のCFTR結合タンパク質CAP70を同定し、これがアピカル面に集中していることを明らかにした。CAP70は、Kocherら(1998)によってPDZK1(603831)として同定されていた。このタンパク質には4つのPDZドメインがあり、そのうちの3つがCFTRのC末端に結合することができる。多価のCAP70または2価のモノクローナル抗体による細胞質C末端の結合を介して少なくとも2つのCFTR分子をリンクさせると、CFTRのClイオンチャネル活性が増強される。このように、CFTRチャネルは、付属タンパク質によって強化された分子間CFTR-CFTR接触の修正を介して、より活性の高い伝導状態に切り替えることができる。

Moyerら(2000)は、CFTRのC末端にPDZ相互作用ドメインがあり、これがCFTRの先端細胞膜への偏向とPDZドメイン含有タンパク質EBP50(604990)との相互作用に必要であることを報告した。PDZドメインは通常、C末端の3〜5個のアミノ酸から構成されており、CFTRではgln-asp-thr-arg-leuとなっている。0位のロイシンをアラニンに点置換すると、CFTRの頂膜偏向性、CFTRとEBP50の相互作用、CFTRの頂膜への効率的な発現、Clの分泌が阻害されることがわかった。2位のスレオニンをアラニンまたはバリンでポイント置換した場合、CFTRのアピカル・ポラライゼーションには影響しなかったが、CFTRとEBP50の相互作用、CFTRのアピカル膜での効率的な発現、および塩化物の分泌が減少した。一方,PDZドメインの他のアミノ酸を個別に点置換しても,測定されたパラメータには影響がなかった。Moyerら(2000)は、CFTRが上皮細胞の頂膜で極性を持たず、EBP50と複合体を形成せず、効率的に発現しないことから、CFTRのC末端を欠失する変異が嚢胞性線維症を引き起こす可能性があると結論づけている。

CFTRは、Clと結合した重炭酸塩輸送など、他のトランスポーターを制御している。正常組織ではアルカリ性の液体が分泌されるのに対し、変異したCFTRを発現する組織では酸性の液体が分泌されることから、この活性の重要性が示されている。重炭酸とpHは、ムチンの粘性と細菌の結合に影響を与える。Choiら(2001)は、実質的に正常なClチャネル活性を保持するCFTR変異体による、塩化物と結合した重炭酸塩輸送を調べた。Choiら(2001)は、膵臓不全を伴う嚢胞性線維症との関連が報告されている変異体は重炭酸輸送をサポートしておらず、膵臓不全との関連が報告されている変異体は重炭酸輸送が減少していることを示した。Choiら(2001)は、今回の発見により、分泌上皮の機能およびCFにおける重炭酸塩輸送の重要性が示されたと結論づけている。

Rowntreeら(2001)は、CFTRのイントロン1(185+10kb)に存在するDNase I hypersensitive site(DHS)を除去すると、レポーター/エンハンサー遺伝子コンストラクトの一過性トランスフェクションアッセイにおいて、このDHSの活性が消失することを示した。CFTRを含むYACをヒト大腸がん細胞株に安定的にトランスフェクションしたところ、DHS要素を欠いたYACからの転写は、インタクトな構築物に比べて60%減少した。トランスジェニックマウスでは、イントロン1のDHSを欠失させても、肺での発現には影響がなかったが、腸での発現は60%減少した。著者らは、イントロン1のDHSに関連する制御要素は組織特異的であり、in vivoでの腸上皮における正常なCFTRの発現レベルに必要であると結論づけている。

CFTRでは、分岐点Aと3-primeスプライスサイトの間にあるポリピリミジントラクトが、エクソンスキップの増加と疾患に関連している。しかし、CFTRでも他の遺伝子でも、多くのエクソンは3-primeスプライスサイトに短いポリピリミジン・トラクトを持っていますが、それらはスキップされません。Hefferonら(2002)は、mRNAの構成エクソンのスキップと、CFTR遺伝子のエクソン9のスキップの分子的基盤を調べた。彼らは、ヒト、マウス、ヒツジの観察結果を報告し、3プライムスプライスサイトの不変のGT以外のヌクレオチドの逸脱、特にそのような変化がポリピリミジン管の短縮など他のスプライシング配列の変化と一緒に見られる場合には、その重要性を改めて強調した。Hefferonら(2002)は、5プライムスプライスサイト全体を注意深く観察することで、スキップされやすい構成的エクソンを特定できる可能性を示唆している。

Broackes-Carterら(2002)は、ヒツジの妊娠期間中の14の時点での定量的mRNAアッセイを用いて、CFTRの発現は第2期の開始時に最も高く、その後、出産までに徐々に低下することを明らかにした。一方、上皮性ナトリウムチャネル(SCNN1A; 600228)の発現は、第3期の開始時から増加した。著者らは、CFTRが呼吸器上皮の分化に関与していることを提唱し、その発現レベルは単に出産間近のナトリウム/塩化物バルクフローの大きな変化を反映しているだけではないことを示唆している。

Eidelmanら(2002)は、CFTRのNBF1がホスファチジルコリンではなくホスファチジルセリンと選択的に相互作用することを発見した。一方、delta-F508変異のNBF1は、これらのリン脂質を識別する能力を失っていた。delta-F508 CFTRを発現しているマウスL細胞では、ホスファチジルコリンを非荷電性アナログで置換すると、CFTRタンパク質の発現が増加した。このことから、delta-F508 CFTR変異体のプロセッシング欠損には、delta-F508 NFB1ドメインとリン脂質シャペロンの相互作用の異常が関与していると考えられる。

delta-F508 CFTRの細胞膜発現は、上皮細胞を27℃で24時間培養することで回復させることができる。Yangら(2003)は、10万種類の多様な低分子をスクリーニングした結果、テトラヒドロベンゾチオフェンが寒冷により膜に結合したdelta-F508 CFTRを活性化し、トランスフェクトしたラット甲状腺上皮細胞に可逆的なCl-コンダクタンスをもたらすことを発見した。単一細胞の電圧クランプ分析では、特徴的なCFTR電流が見られた。活性化には低濃度のcAMPアゴニストが必要であり、通常の生理的反応を模倣している。

ReddyとQuinton(2003)は,ヒト汗管において,細胞質のグルタミン酸によるリン酸化およびATP非依存的なCFTRの活性化が,重炭酸塩コンダクタンスではなく塩化物コンダクタンスのみを誘発することを報告した。また、グルタミン酸で活性化されたCFTRのアニオン選択性は本質的に固定されたものではなく、ATPの加水分解を伴う過程で重炭酸塩を伝導するように動的に変化することも示された。デルタF508変異のあるCFTR患者の管腔細胞では、グルタミン酸/ATPで活性化された塩化物や重炭酸塩のコンダクタンスが見られなかった。一方、R117H(602421.0005)/delta-F508変異のヘテロ接合患者の管腔細胞では、塩化物コンダクタンスのほとんどが失われていたが、重炭酸コンダクタンスは有意に維持されていた。ReddyとQuinton(2003)は、グルタミン酸は神経細胞のイオンチャネルを制御するだけでなく、生来の上皮細胞におけるCFTRのアニオンコンダクタンスと選択性をも制御することができると結論づけている。彼らは、この独自に制御された重炭酸コンダクタンスが失われることが、より重篤な形態の嚢胞性線維症の病態の原因である可能性が高いと提案した。

Wangら(2003)は、子宮内膜上皮細胞がCFTRを介した重炭酸塩輸送機構を持っていることを示した。CFTRに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した子宮内膜細胞や、重炭酸塩分泌不全のCF上皮細胞と精子を共培養すると、精子の受精能や卵子の受精能が低下した。これらの結果は、CFTRが子宮内の重炭酸塩分泌と精子の受精能力の制御に重要な役割を果たしていることと一致しており、CFTRの欠損とCFにおける女性の生殖能力の低下との関連性を示すものと考えられた。

ヒツジとヒトのCFTR遺伝子は、肺の発達過程において、妊娠初期から出産までの間、徐々に発現が低下する。Mouchelら(2003)は、ヒツジのCFTR遺伝子(ov1a)に新規の5プライムエクソンを同定し、エクソン1とは相互に排他的な2つのスプライスフォーム(ov1aLとov1aS)が存在することを明らかにした。ov1aLとov1aSを含むCFTR転写産物は、ヒツジの多くの組織に低レベルで存在していたが、ov1aSは胎児の肺の発達過程で時間的・空間的な調節を示し、CFTRの発現が低下し始める時期に最も多く存在していた。また、ヒトCFTR遺伝子のオルタナティブ5プライムエクソン-1aおよび1aも、肺の発達に伴って発現量の変化を示した。ov1aLとov1aSの構造評価では、リボソームサブユニットの剥離を引き起こすような極めて安定した二次構造を形成する可能性が示された。さらに、CFTRの転写産物からエクソン1が失われたことで、CFTRタンパク質の正常な輸送に重要と考えられるモチーフが取り除かれた。Mouchelら(2003)は、これらの代替的な上流エクソンのリクルートが、CFTRの発現を発達的に制御する新たなメカニズムになるのではないかと仮定した。

Fischerら(2004)は、ビタミンCがCFTRの塩化物チャネルの開口を誘導し、cAMPレベルの上昇が検出されなくても、平均開口確率を増加させることを発見した。気道先端部に生理的濃度のビタミンCを投与すると、気道上皮からの塩化物の分泌が促進された。また、被験者の鼻腔上皮にビタミンCを投与すると、塩化物の輸送が促進された。Fischerら(2004)は、細胞内のビタミンCは、末端のビタミンCトランスポーターを介して、上皮におけるCFTRを介した塩化物の分泌を生物学的に制御していると結論づけている。

Verganiら(2005)は、無傷のCFTR分子のシングルチャネル記録法を用いてチャネルゲートの開閉を直接追跡し、これらの現象をヌクレオチド結合ドメイン(NBD)におけるATPを介したイベントと関連付けることに成功した。その結果、予測されるNBD1-NBD2ダイマー界面の反対側にあると思われる2つのCFTR残基のエネルギー的な結合が、チャネルゲートの状態に応じて変化することを発見した。モニターされた2つの側鎖は、チャネルが閉じている状態では互いに独立しているが、チャネルが開くと結合するようになる。Verganiら(2005)は、今回の結果が、CFTRの細胞質側のヌクレオチド結合ドメインのATPによる強固な二量体化と、膜貫通ドメインのイオンチャネルの開通とを直接結びつけるものであると結論づけている。これにより、ABCタンパク質スーパーファミリーに共通すると思われる、NBDダイマーの界面のダイナミックな再構築を伴う分子メカニズムが確立された。

Wangら(2006)は、プロテオミクスを用いてCFTRタンパク質のグローバルな相互作用を評価し、HSP90(140571参照)コシャペロンがHSP90に依存してCFTRタンパク質のERでの折りたたみの安定性を調節することを示した。ヒト胚性腎臓および肺細胞株において、HSP90コシャペロンATPaseレギュレーターAHA1(AHSA1; 608466)を小腸干渉RNAで部分的にサイレンシングすると、CFTR delta-F508の細胞表面への導入が回復した。Wangら(2006)は、CFTR delta-F508がシャペロンの折り畳み環境の定常状態に応じてエネルギー的に有利な折り畳みを達成できないことが、CFの病態生理に関与していると提唱している。

Thelinら(2007)は、プロテオミクスを用いて、フィラミン(FLNA; 300017)がCFTRのN末端に結合していることを明らかにし、病気の原因となるS13F変異がこの相互作用を阻害することを発見した。細胞実験の結果、FLNAは細胞膜のCFTRを下層のアクチンネットワークに結びつけ、CFTRを細胞表面で安定させ、細胞膜のダイナミクスとチャネルの閉じ込めを制御していることが明らかになった。フィラミンが結合していない場合、CFTRは細胞表面から急速に内在化し、リソソームに早期に蓄積され、最終的には分解される。Thelinら(2007)は、CFTRのN末端は、CFTRの細胞膜の安定性と代謝の安定性の調節に役割を果たしていると結論づけ、S13Fは、タンパク質-タンパク質相互作用を破壊することが判明したCFTRの初めてのミスセンス変異であると述べている。

Chengら(2002)による共免疫沈降分析と免疫蛍光顕微鏡検査により、CAL(GOPC; 606845)がゴルジ体のCFTRのC末端と相互作用することが示された。機能解析の結果、CALとCFTRの相互作用は、細胞表面のCFTRの発現を選択的に阻害することでCFTRの塩化物電流を減少させ、これはNHERF (604990)との競合によって元に戻ることがわかった。

Chengら(2010)は、シンタキシン-6(STX6; 603944)とCALの両方が、リソソームを介した分解によるCFTRのダウンレギュレーションに関与していることを示した。STX6はCFTRのN末端に結合し、CALはCFTRのC末端に独立して結合していた。STX6を過剰発現させると、CFTRの細胞表面での発現が低下し、不安定になったが、CALの非存在下では、またリソソーム阻害剤の存在下では、そのようなことはなかった。逆に、ドミナントネガティブなSTX6変異体の過剰発現やSTX6のノックダウンは、CFTRの安定性をもたらした。STX6とCALは、小胞体に保持され小胞体関連分解を受けるdelta-F508 CFTRの安定性には影響を及ぼさなかった。Chengら(2010)は、STX6とCALがトランスゴルジネットワークで機能し、CFTRのリソソームへの輸送を誘導すると結論づけている。

Rodeら(2012)は、トランスフェクトしたCOS-7細胞とCHO-K1細胞の共免疫沈降法により、ヒト精巣アニオントランスポーター-1(TAT1、またはSLC26A8、608480)が、Cl-およびHCO3-伝導体であるCFTRと相互作用することを発見した。この2つのタンパク質は、ヒト精子頭部の赤道部でコロケーションし、環状部でも部分的にコロケーションしていた。マウスの精子でも同様のコロケーションが見られた。電圧クランプ実験では、TAT1がCFTRを発現させたXenopus卵母細胞のPKA(188830参照)刺激電流を増強し、トランスフェクトしたCHO-K1細胞のcAMP依存性CFTRを介したヨウ化物流出を刺激することが示された。TAT1単独では、CHO-K1細胞におけるヨウ化物の流出を媒介せず、Xenopus卵母細胞の全細胞コンダクタンスにも影響を与えなかったことから、TAT1は電気的に中性の陰イオン交換体であることが示唆された。Rodeら(2012)は、TAT1とCFTRが協力して、精子の運動性と受精能力に必要なCl-/HCO3-フラックスを制御していると結論づけている。

Montoroら(2018)は、シングルセルRNAシーケンシングとin vivo lineage tracingを用いて、マウス気管上皮の構成と階層を研究し、希少な細胞タイプであるFoxi1(601093)陽性の肺イオノサイト、位置に基づくクラブセルの機能的バリエーション、「ヒロック」と彼らが呼んだ高回転の扁平上皮構造における異なる細胞タイプ、および疾患に関連する房状細胞と杯状細胞のサブセットを同定した。Montoroら(2018)は、シングルセルRNA-seqとリネージトレーシングを組み合わせた「パルス-seq」を開発し、房状細胞、神経内分泌細胞、イオノサイト細胞が、基底部の前駆細胞によって継続的かつ直接的に補充されることを示した。イオノサイトは、マウスとヒトの両方において、CFTRの転写産物の主要な供給源である。マウスのイオノサイトでFoxi1をノックアウトすると、Cftrの発現が失われ、気道の液体と粘液の生理機能が乱れ、嚢胞性線維症に特徴的な表現型が見られた。Montoroら(2018年)は、細胞型特異的な発現プログラムを重要な疾患遺伝子と関連付けることで、気道疾患の新しい細胞物語を確立したと結論づけた。

Plasschaertら(2018)は、ヒト気管支上皮細胞とマウス気管上皮細胞のシングルセルプロファイリングを行い、伝導性気道における細胞タイプと、恒常性と再生におけるその挙動の包括的なセンサスを得た。この解析により、既知および新規の細胞集団を代表する細胞の状態が明らかになり、それらの異質性が明らかになり、恒常性や組織修復の際の明確な分化経路が特定されました。さらに、Plasschaertら(2018年)は、彼らが「肺イオノサイト」と呼ぶ、FOXI1、液胞型H(+)-ATPase(V-ATPase)の複数のサブユニット、CFTRを共発現する新規の希少な細胞タイプを同定した。Plasschaertら(2018年)は、免疫蛍光法、シグナル伝達経路の変調、電気生理学を用いて、Notchシグナル(190198年参照)が必要であり、FOXI1の発現は肺イオノサイトの産生を促すのに十分であること、そして肺イオノサイトが伝導性気道上皮におけるCFTR活性の主要な供給源であることを示したのである。

CFTR遺伝子のクローニング

Riordanら(1989)は、嚢胞性線維症(CF;219700)の原因となる推定遺伝子の一部を含むゲノムDNAセグメントを持つ上皮細胞ライブラリから、オーバーラップするcDNAクローンを分離した。その結果、約6,500ヌクレオチドの転写産物が、CF患者の組織で検出された。予測されるタンパク質は、2つの類似したモチーフからなり、それぞれ膜結合に関連する特性を持つドメインと、ATP結合に関連すると考えられるドメインを持つ。また、CF患者では、フェニルアラニン残基が欠失しており、第一ヌクレオチド結合フォールド(NBF)の中心に位置していると考えられる。予測されるタンパク質は、1,480個のアミノ酸を持ち、分子量は168,138 Daである。その特徴は、同じく7qにマッピングされている哺乳類の多剤耐性P-glycoprotein(171050)や、その他多くの膜関連タンパク質と驚くほど類似している。以前に命名されたCF抗原(123885)との混同を避けるために、Riordanら(1989)は、このタンパク質を嚢胞性線維症膜貫通調節因子(CFTR)と呼んだ。

嚢胞性線維症は、逆遺伝学(後にポジショナル・クローニングと呼ばれる)のプロセスによって厳密に解明された最初の遺伝病である。すなわち、地図上の位置に基づいて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(310200)、網膜芽細胞腫(180200)、慢性肉芽腫症(306400)などのヒト疾患遺伝子のクローニングに成功した過去の例のように、染色体の再配列や欠失を利用することなく解明されたのである。Rommensら(1989)は、染色体ウォーキングとジャンピングを組み合わせて、7qのCF領域をカバーすることに成功しました。ジャンピング法は、ヒトゲノムの5%を占めるといわれる「クローン化できない」領域を迂回するのに特に有効であった。酵母人工染色体(YAC)ベクターが代替戦略となる)。もう1つのヒントは、非CFの人の汗腺細胞を培養して作ったcDNAライブラリーをスクリーニングしたことである。これは、CFの染色体に明らかなゲノム再配列がないことや、限られた数のCFの突然変異があることから、突然変異の標的が小さいことが予想されていたため、驚くべき発見でした。

GreenとOlson(1990)は、酵母人工染色体(YAC)を用いてヒトDNAの大きな領域をクローニングし、マッピングするための一般的な戦略を説明した。CFTR遺伝子を含む7番染色体の領域から30個のYACクローンを分析して、1.5Mbp以上のコンティグマップを作成した。また、CF遺伝子全体を含む790kbもの大きさのYACが、オーバーラップしたYACのペアの間で酵母を用いた減数分裂による組み換えによって、in vivoで構築された。Anandら(1991)は、一連のYACクローンに含まれる、CF遺伝子座を挟む2つの遺伝子座を含む1.5Mbpの領域の物理的マッピングを行った。これらのYACのうち1つにはCFTR遺伝子全体が含まれており、310kbのクローンには遺伝子の5プライム方向と3プライム方向の両方のフランキング配列が含まれていた。

CFTR遺伝子異常と疾患

Keremら(1989)は、CF患者に見られる突然変異の約70%が、CF遺伝子の推定産物のアミノ酸508位のフェニルアラニン残基を失う3塩基の特異的な欠失であることを明らかにしました(F508del; 602421.0001)。推定疾患遺伝子座に密接に関連するDNAマーカーに基づくハプロタイプデータから、CFの残りの変異体遺伝子プールは、複数の異なる変異から構成されていることが示唆された。これらの変異アリルのうちのごく一部(約8%)は、膵臓の機能が十分である患者のサブグループにおいて、残存する膵外分泌機能をもたらす可能性がある。最も一般的なCFの異常は、機能ドメイン内の1つのアミノ酸残基の欠損に起因するという発見は、CFの表現型が、遺伝子産物の機能の完全な喪失によるものではないことを示唆している。このような状況は、βグロビン遺伝子の特定のサブセットの突然変異により、異常な挙動を示す変化したタンパク質が生じるシックリング障害に匹敵すると考えられる。β-グロビン遺伝子の機能が完全に失われると、β-0サラセミアという異なる表現型が生じる。同様に、CF遺伝子の機能がホモ接合で失われると、独特の表現型が生じる可能性がある。

Trapnellら(1991)は、細胞診用ブラシを用いた気管支ファイバースコープで採取した呼吸器系上皮細胞のCFTR mRNA転写物を調べた。その結果、正常型とデルタF508型の対立遺伝子が適切な割合で反映されていることがわかった。CFTR mRNAの転写産物は、鼻腔、気管、気管支の上皮細胞に1細胞あたり約1〜2コピー発現しており、咽頭上皮に比べて100倍以上も多かった。Zeitlinら(1992)は、生検したヒトの鼻腔・気管支組織および回腸絨毛組織の頂膜画分のCFTR糖タンパク質を検出するためのポリクローナル抗体を同定した。このタンパク質のレベルは薬理学的に調整された。

Zielenskiら(1991)は、CFTR遺伝子のイントロン17bにおいて、先行するエクソンから200bp下流に、高度に多型的なジヌクレオチドリピートのクラスターを発見した。血縁関係のない92人のCFキャリアーから、TAリピートのサイズが7〜56単位の少なくとも24の対立遺伝子が同定された。共通の対立遺伝子は7、30、31個のジヌクレオチド単位を持ち、CF以外の染色体における頻度はそれぞれ0.22、0.19、0.12であった。また、TAリピートから167bp下流の領域には、多型性の低いCAリピートと呼ばれるジヌクレオチドクラスターが検出された。このCAリピートは、11から17個のジヌクレオチド単位で構成されており、TAリピートとは逆の関係にあるようであった。これらのリピートは、遺伝的連鎖の研究や、未知の変異を持つCFファミリーのカウンセリング、様々な変異型CFアリルの起源の追跡に有用であると考えられた。Morralら(1991)とChehabら(1991)は、CFTR遺伝子のイントロン内のリピートについても述べている。2つのリピート領域の長さの逆相関の意味については調べられていないが、長さの補償が関与している可能性があり、機能的に重要であるかもしれない。

ChalkleyとHarris(1991)は、CFの突然変異を検出するために、白血球におけるCFのmRNAの「異所性」または「非正常」な転写を利用した。PCRを用いることで、ジストロフィン(300377)や第VIII因子(300841)などの他の遺伝子の場合と同様に、このような異所性の転写を検出することができました。Fonknechtenら(1992)は、これらの観察を拡張し、リンパ球とリンパ芽細胞の研究において、CFTRの変異を検出するためにPCR反応を使用した。Ferrieら(1992)は、CFTR遺伝子の突然変異の検出にARMS(amplification refractory mutation system)を適用した。

Cuttingら(1990)は、白人のCF患者20人とアメリカ黒人のCF患者18人のエクソン9、10、11、12(第1のNBFをコードしている)とエクソン20、21、22(第2のNBFの大部分をコードしている)のヌクレオチド配列を調べて、CFTRの2つのNBFに変異を求めました。その結果、エクソン11の30bpの領域に4つの変異が集積していることがわかった。このうち3つの変異は、CFTRタンパク質、多剤耐性タンパク質、ATP結合膜関連輸送タンパク質の間で高度に保存されている残基で、アミノ酸置換が生じていた。また、4番目の変異では、早期終了シグナルが生じていた。

Yangら(1993)は、CF患者の塩化物輸送障害の分子メカニズムを探るために、レトロウイルスを導入したL細胞において、野生型、delF508(602421.0001)、G551D(602421.0013)のCFTRのプロセッシング、局在、機能を調べた。その結果、G551Dの分子病態はチャネル活性の異常で説明されるのに対し、delF508の欠損はチャネル機能の部分的な欠損に加えて、タンパク質の誤局在化と不安定性が組み合わさったものであると結論づけた。彼らの観察によると、潜在的なCFTRを活性化することで、CFの薬物療法の可能性が示唆されています。

嚢胞性線維症の原因となる突然変異には不均一性があるだけでなく、その発症メカニズムも様々である。フェニルアラニン508の欠失は、正常な生合成過程が阻害されることにより、小胞体内に変異タンパク質が保持され、分解されることで疾患を引き起こすと考えられる。比較的よく見られるgly551-to-asp変異のような他の変異は、生合成が正常に行われているように見えるので、何らかの別のメカニズムで病気を引き起こすに違いない。デルタF508とG551Dは、CFTRのヌクレオチド結合ドメイン(NBD)内に存在するため、Loganら(1994)は、これらの変異がCFTRのヌクレオチド結合に与える影響を調べた。その結果、G551Dと、それに対応するCFTRの第2ヌクレオチド結合ドメインの変異であるgly1349-to-asp(G1349D)は、CFTRのNBDによるヌクレオチド結合が減少し、delta-F508の変異はヌクレオチド結合に影響を与えないことがわかった。また、原核生物や真核生物の30以上のヌクレオチド結合ドメインに存在する高度に保存された領域の構造的完全性が、正常なヌクレオチド結合に重要である可能性が示唆された。

CFTR遺伝子のイントロン8の末端には、チミジンが多形に並んでおり、この部位に存在するチミジンの数(5、7、9)によって3つの異なる対立遺伝子が存在する(Chuら、1991年)。このチミジンの数によって、イントロン8のスプライスアクセプターサイトの利用効率が決まる。チミジン残基の長さが短いほど、効率は低下する。したがって、機能的に重要な第1ヌクレオチド結合ドメインの一部をコードするエクソン9配列を欠くCFTR転写産物は、チミジン残基の伸びが短いほど高い割合で見出されることになる(Chu et al. arg117からhisへの変異(R117H)を持つCFTR遺伝子(602421.0005)がT5対立遺伝子を持っていれば、その変異遺伝子がCFの原因となる。T7対立遺伝子を保有するR117H変異のCFTR遺伝子は、CFまたはCBAVDのいずれかをもたらす(Kiesewetter et al., 1993)。Tengら(1997)は、T5対立遺伝子がこのスプライスアクセプターサイトを最も非効率的に使用することを指摘している。そのため、T5対立遺伝子のCFTR転写産物の多くは、エクソン9の配列が欠損している。このようなエクソン9欠損のCFTR転写産物は、CFTRタンパク質に翻訳されても成熟せず、上皮細胞の頂膜で塩化物チャネルとして機能しないことが知られている。CBAVD患者では、このT5対立遺伝子の頻度は、対照集団に比べて4~6倍高くなっています(602421.0005参照)。Tengら(1997)は、鼻腔上皮細胞および精管細胞におけるCFTR転写産物を定性的および定量的に分析した。鼻腔上皮細胞で発生することが知られていたエクソン9の代替スプライシングは、精管細胞でも発生していた。この代替スプライシングの程度は、CFTR遺伝子のイントロン8の末端にあるTn遺伝子座に存在する対立遺伝子によって決定された。しかし、エクソン9の配列を欠く転写産物の割合は、Tn遺伝子型とは無関係に、鼻腔上皮細胞に比べて膣分泌腺細胞で増加していた。このことから、Tengら(1997)は、エクソン9配列を欠くCFTR転写産物の割合の組織特異的な違いが、CBAVD患者に見られる組織特異的な疾患表現型に寄与しているのではないかと推測した。

CFTR遺伝子には、多型のあるTn遺伝子座の他に、120以上の多型が報告されている。Cuppensら(1998)は、いくつかの多型遺伝子座で特定の対立遺伝子が組み合わされると、CFTRタンパク質の機能が低下したり、あるいは不足したりするのではないかと考えた。一般集団において対立遺伝子の頻度が高い3つの多型遺伝子座を解析したところ、Tn遺伝子座の影響が知られているのに加えて、他の2つの多型遺伝子座によってもCFTRの転写物やタンパク質の量や質に影響があることがわかった。M470V(602421.0023)と二塩基反復多型(TG)mであった。T7バックグラウンドでは、(TG)10対立遺伝子と比較して、(TG)11対立遺伝子ではエクソン9を欠くCFTR転写産物の割合が2.8倍に、(TG)12では6倍に増加した。また、患者由来のT5 CFTR遺伝子は、TGリピートの数が多く、健康なCFの父親由来のT5 CFTR遺伝子は、TGリピートの数が少ないことがわかった。さらに、M470 CFTRタンパク質はV470 CFTRタンパク質に比べて成熟が遅く、内在性クロライドチャネル活性が1.7倍高いことが判明し、M470V遺伝子座がT5の疾患変異としての部分的な浸透にも関与している可能性が示唆された。このような多価の変異遺伝子は、一見正常なCFTR遺伝子が病気を引き起こす理由を説明できるかもしれない。さらに、CFTRの変異による表現型の違いの原因にもなっているかもしれない。本研究は、遺伝性疾患に関連する多型の遺伝的および機能的研究が、単発性疾患と複合形質の両方に関連して、大きな関心事になることを示唆している。

Pignattiら(1996)は、16例の播種性気管支拡張症のうち9例(56%)において、イントロン8の5T対立遺伝子(IVS8-5T)および/またはCFTR遺伝子の変異を発見した。その結果、CFと一つの閉塞性肺疾患である原因不明の播種性気管支拡張症との間に臨床的な関連性があることが、分子遺伝学的レベルで確認されました。同様に、Girodonら(1997)は、播種性気管支拡張症と臨床的に孤立した呼吸器症候群を持つ32人の患者を研究しました。CFTR遺伝子の全エクソンとその周辺領域を解析したところ、16の異なる対立遺伝子に13のCFTR遺伝子変異が認められた。これらの変異のうち6つは,以前にCFの欠陥として報告されていたもので,9つの対立遺伝子に見られた。4人の患者は複合ヘテロ接合体であり、6人は1つの変異に対するヘテロ接合体であった。Girodonら(1997)は、CFTR遺伝子の変異は気管支拡張性肺疾患において、おそらく多因子的な状況で役割を果たしている可能性があると結論づけている。

CFTR遺伝子のヘテロ接合状態での突然変異は、感染症に対する抵抗力を高め、その結果、選択された集団において変異型CFTR対立遺伝子が高いレベルで維持されるという提案がなされている。Pierら(1998)は、腸チフスがそのような疾患の一つであるかどうかを調べた。腸チフスは、Salmonella typhiが消化管上皮細胞に侵入し、粘膜下転位することで発症する。彼らは、関連するネズミの病原体S. typhimuriumではなく、S. typhiが上皮細胞への侵入にCFTRを使用することを発見した。野生型CFTRを発現している細胞は、最も一般的なCFTRの変異であるdelta-F508を発現している同種の細胞よりも多くのS. typhiを体内に取り込んだ(602421.0001)。CFTRの第1予測細胞外ドメインに対応する配列を含むモノクローナル抗体および合成ペプチドは,S. typhiの取り込みを阻害した.delta-F508 Cftrのヘテロ接合マウスでは,野生型Cftrマウスと比較して,消化管粘膜下層へのS. typhiの取り込みが86%少なかったが,delta-F508 Cftrのホモ接合マウスでは取り込みは起こらなかった.Cftrの遺伝子型はS. typhimuriumのトランスロケーションに影響を及ぼさなかった。免疫電子顕微鏡で見ると、Cftr野生型マウスの粘膜下層ではdelta-F508ヘテロ接合体マウスよりも多くのCFTRがS. typhiと結合していた。Pierら(1998)は、ヘテロ接合体のCFTRレベルが低下すると、腸チフスに対する感受性が低下すると結論づけている。

Van de Vosseら(2005)は、CFTRヘテロ接合体が腸チフスに対して選択的に有利であるという仮説を検証した。この仮説は、腸粘膜へのS. typhiの付着を減少させることによってもたらされる可能性がある。彼らは、インドネシアの腸チフス流行地域の患者と対照者を対象に、CFTRの2つの多型性の高いマーカーと、最も一般的なCFの突然変異であるF508delの遺伝子型を調べた。インドネシアではCFの発症率が非常に低いことと同様に、F508del変異は患者にも対照者にも存在しませんでした。しかし、彼らはイントロン8にある共通の多型(16または17のCAリピート)と腸チフスに対する選択的優位性との間に有意な関連性を見出しました。

Sharerら(1998年)は、連続した134人の慢性膵炎患者(167800人)を調査した(アルコール関連疾患71人、副甲状腺機能亢進症2人、高トリグリセリド血症1人、特発性疾患60人)。DNAは、調査が行われたイングランド北西部の嚢胞性線維症患者において、合わせて全変異の95%を占める22のCFTR遺伝子の変異を調べました。また、イントロン8にあるチミジンの非コード配列の長さを調べました。これは、配列が短いほど、正常なCFTR mRNAの割合が低くなるためです。CFTR遺伝子の両方のコピーに変異がある患者はいませんでした。アルコール依存症のない12人を含む18人(13.4%)の患者は、1本の染色体にCFTRの変異を有していた。これは、嚢胞性線維症の家族歴を持つ600人の地元の血縁関係のないパートナーの間では5.3%の頻度であった(Pは0.001未満)。患者の10.4%(134人中14人)がイントロン8に5T対立遺伝子を持っており、これは予想される頻度の2倍であった(P = 0.008)。4 名の患者は CFTR 変異と 5T 対立遺伝子の両方を持つヘテロ接合体であった。CFTR 変異を持つ患者は、変異を持たない患者よりも若かった(P = 0.03)。嚢胞性線維症の診断に必要な副肺疾患、高い汗中電解質濃度、低い鼻腔電位差値を併せ持つ患者はいなかった。

同様に、Cohnら(1998)は、特発性膵炎の評価のために紹介された27人の患者(診断時の平均年齢36歳)を調査し、そのうち22人が女性であった。DNA検査では、17種類のCFTR変異と、イントロン8の5T対立遺伝子が検出された。5T対立遺伝子は、機能的なCFTRのレベルを低下させ、男性の遺伝性不妊症であるCBAVDと関連している。Cohnら(1998)は、特発性慢性膵炎の患者10名(37%)が少なくとも1つの異常なCFTR対立遺伝子を持っていることを発見しました。8 個の CFTR 変異が検出されました。3人の患者では両方の対立遺伝子が影響を受けていた。この3人の患者は、汗検査、スパイロメトリー、ベースラインの鼻腔内電位差測定の結果、嚢胞性線維症に典型的な肺疾患を有していませんでした。それにもかかわらず、3人とも鼻腔内のサイクリックAMPを介した塩化物輸送に異常が見られた。3名の患者の遺伝子型は、delF508/Wildtype(602421.0001)、9T/5Tが2名、delF508/R117H(602421.0005)、9T/7Tが1名で、これらはCBAVD患者に最も多い2つの遺伝子型です。これらの遺伝子型では、通常、肺疾患は発症しません。対照的に、delF508/R117H、9T/5Tの遺伝子型を持つ患者では、肺疾患が見られます。

CFTR遺伝子のイントロン8にある5Tの短縮型トラクトは、約10%の人に見られます。Gromanら(2004年)は、5Tに隣接するTGリピートの数が疾患の浸透性に影響を与えるかどうかを調べるために、先天性精管欠乏症(277180)による男性不妊患者98人、非古典的CF患者9人、および27人の非罹患者(妊娠可能な男性)のTGリピート数を測定した。この研究の各個人は、一方のCFTR遺伝子に重度のCFTR変異があり、もう一方のCFTR遺伝子に5Tがありました。罹患していない人の78%(27人中21人)は、5Tが11個のTGリピートに隣接していたのに対し、罹患している人では9%(107人中10人)であった。逆に、患児の91%(107人中97人)が12または13個のTGリピートを持っていたのに対し、非患児では22%(27人中6人)しか持っていなかった(Pは0.00001未満)。5Tが12または13個のTGリピートに隣接している人は、5Tが11個のTGリピートに隣接している人に比べて、異常な表現型を示す可能性が大幅に高かった(オッズ比34.0、95%CI 11.1-103.7.7、P 0.00001以下)。このように、TGリピート数を決定すれば、良性の5T対立遺伝子と病原性の5T対立遺伝子をより正確に予測することができる。

Leeら(2003)は、韓国人対照者117名と気管支拡張症または慢性膵炎のCF患者75名を対象に、CFTRの11種類の多型を用いてハプロタイプ解析を行った。いくつかのハプロタイプ、特にQ1352H (602421.0133), IVS8 T5 (602421.0086), E217G (602421.0134)のハプロタイプは、症例対照研究において疾患との関連が認められた。共通のM470V多型(602421.0023)は、疾患との関連の強さに影響を与えているようであった。T5-V470ハプロタイプはT5-M470よりも高い疾患関連性を示したが、V470を背景としたQ1352H変異が最も強い疾患関連性を示した。M470背景の非同義のE217GおよびQ1352H変異は、CFTR依存性の塩化物電流および重炭酸塩輸送活性を60~80%低下させた。M470V多型変異とQ1352H変異の組み合わせでは、CFTR依存性の陰イオン輸送活性が完全に消失した。この結果から、複数の遺伝子変異のシスにおける相互作用が、遺伝子産物の最終的な機能に影響を与えていることが明らかになった。

Burattiら(2001)は、核内因子TDP43(605078)がCFTR pre-mRNAのUGリピート配列に特異的に結合し、その結果、CFTRエクソン9のスキップを促進することを示した。Wangら(2004)は、ミニジーンシステムにおいて、ヒトTDP43のマウスホモログもヒトCFTRエクソン9のスプライシングを阻害することを発見した。Burattiら(2004)は、CFTRのイントロン8にあるTGリピートがTDP43と結合し、このタンパク質がエクソン9のスプライシングを阻害するというモデルと一致する実験結果を発表した。この結果は、Gromanら(2004)の関連データをメカニズム的に説明するものであり、また、TGリピートの表現型浸透率が変化することの説明にもなるとしている。この抑制性スプライシング因子の濃度の個人差や組織差が、多系統性(非classic CF)の疾患を発症するか、単症候性(CBAVD)の疾患を発症するかを決定する可能性もある。

Audrezetら(2002)は、特発性慢性膵炎のフランス人白人患者39人を対象に、CFTR遺伝子の全コード配列とエクソン/イントロン接合部を変性高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)とダイレクトシークエンスで解析した。その結果、14名の患者(35.9%)に合計18個の変異アリルが同定され、そのうち4名は複合ヘテロ接合体であった。この4人の複合ヘテロ接合体は、再評価の結果、CFに関連する肺症状が認められなかった。しかし、そのうちの2人は、過去に行われた発汗検査が陽性であった。CFTR遺伝子のイントロン8の末端にあるチミジンの多型文字列の5T対立遺伝子は、検査を受けた36人の患者のうち7人に存在し、対立遺伝子の頻度(9.7%)は、一般人口における5%の割合の約2倍であった(P = 0.09)。

嚢胞性線維症の分子病態については、delF508 CFTRをさまざまな異種生物系で解析することで調べられ、タンパク質の成熟不全によるCFTRの発現の異常が明らかになった。変異体CFTRは、小胞体から出てゴルジ体で処理されるプロテアーゼ抵抗性の成熟構造をとることができず、野生型の初期段階で停止していることがわかった(Chengら、1990年、Gregoryら、1991年、Zhangら、1998年)。Pindら(1994年)およびYangら(1993年)の実験では、未成熟なdelF508 CFTRとシャペロンであるカルネキシン(CANX;114217)およびHsp70(140550参照)との長期にわたる相互作用により、異常なタンパク質が細胞の品質管理によって認識され、ユビキチン-プロテアソーム経路による早期分解がプレゴルジコンパートメントで行われることが示された(Jensenら、1995年、Satoら、1998年)。温度を下げたり(Denningら、1992年)、グリセロール(Satoら、1996年)やトリメチルアミン-N-オキシド(Brownら、1996年)などの化学的なシャペロンを加えたりすることで、delF508 CFTRの折り畳み経路の障害を克服し、適切なターゲッティングが可能になったことから、変異タンパク質はまだ成熟したコンフォメーションをとることができることが示された。しかし、細胞表面に形成された塩化物チャネルは、半減期が短く、開通確率やcAMPアゴニストによる刺激に対する感度が低下していました。

Kalinら(1999)は、delF508ホモ接合患者と非CF患者の皮膚生検、呼吸器・腸管組織標本における内因性CFTRの発現を、CFTR抗体パネルを用いた免疫組織化学的分析とイムノブロット分析により調べました。CFTRの発現は、再吸収性汗管や気道粘膜下腺の内腔表面、仮骨化呼吸器上皮の繊毛細胞の頂点、十二指腸や空腸の絨毛細胞の単離細胞、腸杯細胞の細胞内で検出された。delF508ホモ接合体の患者では、変異タンパク質の発現は組織特異的であることが判明した。delF508 CFTRは汗腺では検出されませんでしたが、呼吸器や腸管での発現は信号強度や局在によって野生型と区別できませんでした。組織特異的にdelF508 CFTRの発現が欠損から見かけ上正常な量に変化することは、delF508 CFTRの成熟度が調節されることを示しており、CFTRの誤局在化以外の決定要因がdelF508 CFの呼吸器疾患や腸疾患に関与していることが示唆されました。

WelshとSmith(1993)は、CFTRの変異が嚢胞性線維症を引き起こすメカニズムの分類を行った。変異を5つのクラスに分類したのは、その機能的効果に基づいている。(I)蛋白質生産の欠陥、(II)蛋白質処理の欠陥、(III)蛋白質制御の欠陥、(IV)蛋白質コンダクタンスの欠陥、(V)機能的なCFTR蛋白質の量の減少。クラスI、II、IIIの変異は、臨床研究に基づき、典型的な重症多臓器疾患と関連している。対照的に、クラスIVおよびVの変異は、表現型が軽度になるのに十分な機能的CFTRを与えていると思われる。

Haardtら(1999)は、CFに関連する様々なクラスの突然変異を見直し、暫定的にクラスVIを追加した。彼らは、突然変異は2つの大きなカテゴリーに分類されると提案しています。第一のグループには、生合成がうまくいかないため(クラスIとクラスV)、あるいは小胞体での折り畳みがうまくいかないため(クラスII)、細胞表面に蓄積できない変異体が含まれる。2番目のカテゴリーに属する変異体は、細胞表面で発現しているが、活性化(クラスIV)またはチャネルのコンダクタンス(クラスIII)の欠陥により、塩化物イオンの輸送に失敗する。Haardtら(1999)は、切断型CFTRの生合成過程と巨視的な塩化物チャネル機能は正常であるが、成熟した複雑なグリコシル化された形態の生物学的安定性が劇的に低下していると思われることから、彼らの実験で特徴づけられたような安定性変異体を含むクラスVIを提案した。

Mickleら(2000)は、病気の原因となる突然変異がCFTRの調節機能に与える影響を調べるために、CFまたはそれよりも軽い表現型である先天性両側性精管欠乏症(277180)に関連する変異を持つCFTRを一時的に発現させ、変異したCFTRが外向き整流性塩化物チャネル(ORCC)を調節できるかどうかを調べた。その結果、第1ヌクレオチド結合ドメインにCF関連の変異(602421.0001)があるCFTRは、塩化物チャネルとして機能したが、ORCCを制御しなかった。しかし、他のドメインに疾患関連の突然変異を持つCFTRは、関連する表現型にかかわらず、両方の機能を保持していた。このように、CFTRの制御機能の喪失と疾患の重症度との関係は、別々のチャネルの制御に重要と思われるCFTRの領域であるNBD1について明らかになっている。

Bronsveldら(2001)は、delta-F508の双子と兄弟の呼吸器と腸管の塩化物輸送特性を調べた。呼吸器組織では、CFTRを介した塩化物コンダクタンスの基礎的な発現が、delta-F508ホモ接合体の30%に認められ、より軽いCFのポジティブな予測因子として同定されました。腸管組織では、CFTRチャネルが機能していることを示す4,4-prim-diisothiocyanatostilbene-2,2-prim-disulfonic acid(DIDS)非感受性塩化物分泌が、より軽度の表現型と相関していましたが、DIDS感受性塩化物分泌は主に重度の患者で観察されました。Bronsveldら(2001)は、delta-F508患者では、CFの経過に主に関与する臓器での塩化物分泌能力がCFの表現型を予測するものであると結論づけています。

Bobadillaら(2002年)は、各地域における疾患の進展を理解し、スクリーニングプログラムの決定に役立つ知見を得ることを目的として、世界中のできるだけ多くの地域におけるCFTRの変異の分布を明らかにしました。世界中で幅広い変異の不均一性が見られましたが、ほとんどの集団で最も一般的な変異の特徴を把握することができました。デルタF508の頻度と地域のCF発症率との間には、有意な正の相関関係が認められた。

原発性硬化性胆管炎(PSC; 109720参照)は、胆道の線維芽細胞性炎症を特徴とする緩徐に進行する胆汁性肝疾患で、肝硬変や門脈圧亢進症を引き起こし、肝移植の主要な適応症となります。Shethら(2003)は、75〜80%の症例が炎症性腸疾患(IBD;266600)と関連しており、IBD患者の2.5〜7.5%がPSCを発症すると述べています(Lee and Kaplan, 1995)。Shethら(2003)は、IBD患者の一部がPSCを発症する理由は、CFTRの機能障害にあるのではないかと考えました。彼らは、19人のPSC患者のCFTR遺伝子型と表現型を、18人のIBDで肝疾患のない患者、17人の原発性胆汁性肝硬変(PBC; 109720)、81人のCF、51人の健常対照者と比較して、前向きに評価しました。その結果、PSCでは、ヘテロ接合状態のCFTR異常の有病率が高いことが、分子的および機能的解析によって示され、これらの異常が、IBD患者の一部においてPSCの発症に寄与している可能性があると結論付けました。PSC患者の89%が1540G変異体(602421.0023)を含む遺伝子型を持ち、CFTRの機能が低下していたが、対照群の57%と比較した(P = 0.03)。PSC患者19名のうち、CFTRの変異も1540Gバリアントも持たないのは1名のみであった。鼻腔電位差検査でCFTRのクロライドチャネル機能を評価したところ、PSC患者では疾患対照者および健常対照者と比較してイソプロテレノール反応の中央値が低下していた。

Paganiら(2003)は、CFTR遺伝子のエクソン12におけるいくつかのヌクレオチドの変化がエクソンスキッピングの程度を変化させ、正常な転写産物のレベルを低下させることを示した。この現象は、2つの自然変異(1つはgly576→ala(G576A; 602421.0061))と、いくつかの部位特異的な無声置換で見られた。この現象は、著者らがCERES(composite exonic regulatory element of splicing)と名づけた調節要素の干渉によるものであった。CERESでの一塩基置換の効果は、セリン-アルギニンリッチ(SR)マトリックスやエンハンサーの同定では予測できなかった。Paganiら(2003)は、多型と病原性突然変異を区別するために、適切な機能的スプライシングアッセイを遺伝子型スクリーニングに含めるべきであると提案した。

Paganiら(2005)は、ヒトCFTRエクソン12のヌクレオチド13から52までの19個の同義置換をテストした結果、単一の同義置換でエクソンスキップを誘発する確率は約30%であることを明らかにし、同義置換がスプライシングに影響を与える可能性があり、スプライシングの要求によって制約を受けることがあるため、進化において中立ではないことを示した。Paganiら(2005)は、ゲノム変異の進化的選択は、スプライシング制御とタンパク質機能の最適化という2つの連続したレベルで行われることを示唆している。

Aznarezら(2003)は、CFTR遺伝子のエクソン13に存在する推定エクソンスプライシングエンハンサー(ESE)の機能に、2つのCF疾患の原因となる突然変異が及ぼす影響を調べた。2つの変異はいずれも予測された方法でスプライシング異常を引き起こし、推定ESE配列がプレmRNAのスプライシングに関与していることを裏付けた。さらに、D648V(602421.0097)を含む3つの変異は、2つの暗号化された3プライムスプライスサイトのポリピリミジントラックを改善することによって、エクソン13のスプライシング異常を引き起こした。また、2つのスプライシング因子であるTra2α(TRA2A;602718)とSF2/ASF(SFRS1;600812)の相対的なレベルによって、いくつかのエクソン13病変のスプライシングへの影響が変化していた。著者らは、CFTRのプレmRNAスプライシングの忠実度の変化によって、CFの重症度が調節されている可能性を示唆している。

Audrezetら(2004)は、QMPSF(Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments)を用いて、CFTR遺伝子の27エクソンに大きなゲノム再配列がないかどうかを初めて系統的にスクリーニングしたことを報告した。CFTRの多くの疾患対立遺伝子がこれまでに同定されていたが、一部の集団では最大30%の疾患対立遺伝子がまだ同定されておらず、これらの未同定の対立遺伝子はゲノムの大規模な再編成によって説明できると考えられていた。Audrezetら(2004年)は、少なくとも1つの未確認対立遺伝子を持つ古典的なCF患者39人のよく知られたコホートを調査しました。QMPSFを用いて、これまで同定されていなかったCFの突然変異アリルの約16%が同定され、その特徴が明らかになりました。その中には、5つの新しい突然変異(大きな欠失が1つ、挿入/欠失が4つ)が含まれていました。これら5つの突然変異のブレークポイントは正確に決定された。5つの複合病変はすべて非相同組換えで説明できるが、それぞれの変異は異なるメカニズムで生じたと考えられる。そのうちの1つは、レトロトランスポジションに適したLINE-1要素と部分的に相同性のある41bpの短い配列が挿入されているという、非常に珍しいものであった。Audrezetら(2004)は、この超短いLINE-1要素(「ハイフン要素」と呼ばれる)の挿入が、ヒトの遺伝病に関連する新しいタイプの突然変異を構成する可能性を示唆している。

ジヌクレオチドリピートは、真核生物のゲノムに普遍的に存在する機能である。ジヌクレオチドリピートは真核生物のゲノムに普遍的に存在する特徴であり、その性質は非常に可変であることから、スプライシングシグナルの近傍に存在する場合には、RNAスプライシングの修飾因子として特に興味深い候補となる。スプライシングに影響を及ぼすジヌクレオチドリピートの例として、CFTR遺伝子のエクソン9のスプライスアクセプターに存在するTGリピートが挙げられる。リピート数が多いと、エクソン9のスプライシング効率が低下し、場合によっては、完全長の転写産物の減少が、先天性両側性精管欠乏症(277180)や非古典性嚢胞性線維症による男性不妊の原因になることもある。Hefferonら(2004)は、CFTRのミニジーンシステムを用いてTGトラクトの変異を調べ、生体内で見られたようなジヌクレオチドリピート数とエクソン9のスプライシング効率の相関関係を観察した。ミニジーン内のTGジヌクレオチドトラクトをランダムな配列で配置したところ、エクソン9のスプライシングが行われなくなった。このTGジヌクレオチドを自己塩基置換可能な配列に置き換えると、RNA二次構造の形成が効率的なスプライシングと関連することが示唆された。しかし、スプライシング効率は、予測されたそのような構造の熱力学的安定性と逆相関しており、中間的な安定性が最適であることを示していた。最後に、長さの異なるTAリピートで置換すると、配列の内容ではなく、RNA二次構造の安定性がスプライシング効率に相関することが確認された。Hefferonら(2004)は、ジヌクレオチドリピートが二次構造を形成し、それがRNAスプライシング効率や臨床表現型に様々な影響を与えると結論づけている。

Wongら(2003)は、父親が台湾人、母親がベトナム人の子供の膵臓不全CFを報告しました。この子はエクソン1にglu7→ter(602421.0131)と1bp挿入の989A(602421.0132)という2つの異なるヌル変異を持っており、フレームシフトを起こして306アミノ酸のCFTRタンパク質が切断されていた。Wongら(2003)は、東アジアのCF患者が他の民族の患者と変異を共有していないことについてコメントしています。東アジア人の中でも、中国の患者のCFTRの変異スペクトルは、日本人の患者のそれとは異なる。

Changら(2007年)は、特発性慢性膵炎(ICP;167800)の中国人・台湾人患者78人の全対立遺伝子の14.1%と24.4%にCFTR遺伝子の変異を同定したのに対し、マッチさせた200人の対照群の全対立遺伝子の4.8%と9.5%に変異を同定しました。その結果、CFTR遺伝子変異のヘテロ接合型キャリアーは、ICPを発症するリスクが高いことが示唆されました。確認された変異は、欧米諸国で通常観察されるものとは異なっていました。12または13のTGリピートを持つT5対立遺伝子は、ICP患者の発症年齢の早期化と有意に関連していたが、この対立遺伝子の頻度は患者と対照者の間で差がなかった。

Sunら(2006年)は、イントロン8の5Tバリアントとエクソン10のコドン470に隣接する多形性TGジヌクレオチドリピートを解析した。この研究に選ばれた患者は、5Tバリアントと嚢胞性線維症の主要な突然変異であるdelta-F508の両方が陽性であった。ほとんどすべてのdelta-F508変異は、10TG-9T-470Mのハプロタイプで発生する。そのため、トランスの5Tバリアントのハプロタイプを判定することが可能です。解析した74サンプルのうち、41(55%)が11TG-5T-470M、31(42%)が12TG-5T-470V、2(3%)が13TG-5T-470Mであった。Sunら(2006)は、臨床情報が得られた49例のうち、女性の17.6%(34例中6例)、男性の66.7%(15例中10例)に非定型嚢胞性線維症に類似した症状が見られたと報告しています。その結果、女性では42%(12人中5人)、男性では80%以上(6人中5人)の高い浸透率を示したハプロタイプは12TG-5T-470Vであった。著者らはまた、先天性両側性精管欠乏症の男性12人を評価し、5Tバリアントに陽性で、12人中10人が12TG-5T-470Vのハプロタイプであった。Sunら(2006)は、5Tバリアントは全体的に、これまで女性で推定されていたよりも臨床的には軽度であると結論づけている。5Tバリアントの臨床症状は、5T-12TG-470Mハプロタイプと関連しています。

Alonsoら(2007年)は、突然変異の分子スペクトルを定義するために、1,954のスペインの嚢胞性線維症の対立遺伝子を分析した。市販のパネルでは検出力に限界があり、76%の対立遺伝子しか同定できなかった。より感度の高い検査法では、1%以上の頻度で12の変異が同定され、中でもF508del変異は最も頻度が高く、対立遺伝子の51%に存在していた。スペイン人集団では、80%の検出率を達成するためには、18個の変異が必要であった。51の変異(42%)が一度だけ観察された。Alonsoら(2007)は、CFの対立遺伝子の96%を占める合計121の疾患原因となる突然変異を同定しました。

アミノグリコシド系抗生物質の効果

アミノグリコシド系抗生物質は、抗菌作用に加えて、停止コドンの代わりにアミノ酸を取り込むことで、早発の終止コドンを抑制し、転写産物の正常な末端まで翻訳を継続させることができる。翻訳終了のメカニズムは、ほとんどの生物で高度に保存されており、ほとんどの場合、アンバー(UAG)、オーカー(UAA)、オパール(UGA)の終止コドンで合図される。終止コドンの周辺のヌクレオチド配列は、翻訳終了の効率を決定する上で重要な役割を果たしている。アミノグリコシド系抗生物質は、主にリボソームの「プルーフリーディング」を阻害することで、翻訳の忠実度を低下させる。このようにして、アミノグリコシドは、ナンセンスコドンへの誤挿入の頻度を高め、遺伝子の最後まで翻訳を継続させる。これは、ヒト線維芽細胞を含む真核細胞(Burke and Mogg, 1985)で示されている(Buchanan et al.

Howardら(1996)は、2つのCFTR関連停止変異が、細胞を低用量のアミノグリコシド抗生物質で処理することによって抑制されることを示した。他にも、CFTRのナンセンス変異を持つ培養細胞や、マウスの筋ジストロフィーのストップ変異に関連して、また、ハーラー症候群(607014)やシスチン症(219800)などの疾患のin vitroでもこの効果が実証された。

CFTR W1282X(602421.0022)変異を有するCF気管支細胞株において、Bedwellら(1997)は、アミノグリコシドであるG418およびゲンタマイシンで処理すると、cAMP活性化塩化物電流の再出現、先端細胞膜におけるCFTRタンパク質の回復、およびW1282X対立遺伝子からのCFTR mRNAレベルの豊富さの増加によって示されるように、CFTRの発現が回復することを実証した。

Wilschanskiら(2003年)は、CFTRのstop変異を持つ患者にゲンタマイシンの鼻腔内投与を行う二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験を、delta-F508変異のホモ接合患者と比較して実施しました。鼻腔電位差は、ベースライン時と各治療後に測定されました。ゲンタマイシン投与により、停止変異を有する19名の患者の鼻腔電位差の基礎値が有意に低下し、塩化物を含まないイソプロテレノール溶液にも有意な反応が見られた。この鼻腔電位差に対するゲンタマイシンの効果は、stop変異を持つホモ接合の患者とヘテロ接合の患者の両方で生じたが、delta-F508を持つホモ接合の患者では生じなかった。ゲンタマイシン投与後,ストップ変異を持つ患者の鼻腔上皮細胞では,CFTRの末梢および表面の染色性が有意に上昇した。